Ko’áĝa†Dirección ko’áĝagua: OX11 0DE, Reino Unido, Edificio Diamante, Parque de Ciencia y Innovación Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Reino Unido, Diamond Light Source Co., Ltd., Centro de Imagen Biológica Electrónica.
Pe complejo centro de reacción cosecha de luz 1 (RC-LH1) ha e pe componente fotosintético núcleo bacteria fototrófica púrpura rehegua. Roikuaauka mokõi estructura microscopía crioelectrónica rehegua complejo RC-LH1 Rhodopseudomonas palustris-gui. Pe estructura resolución 2,65-Å complejo RC-LH114-W rehegua oguereko 14 bucle subunidad LH1 ojeréva RC rehe, oñeinterrumpíva proteína W rupive, ha katu pe complejo ndorekóiva proteína-W ha e composición RC completamente ojeréva RC rehe. Oñemboty 16 subunidad LH1 bucle. Oñembojojávo ko ã estructura ome e jesareko dinámica quinona rehegua complejo RC-LH1-pe, oikehápe umi cambio conformacional ndojedeterminaiva ekue yma oñembojoaju jave quinona RC QB tendape, avei moõpa oĩ umi sitio de unión quinona auxiliar, oipytyvõva Ohasávo RC-pe. Pe estructura ijojaha yva proteína W rehegua ojoko oñemboty hagua pe bucle LH1, upéicha rupi ojejapo petet canal oñembopya e hagua intercambio quinona/quinolona rehegua.
Pe energía ome'êva fotosíntesis ikatu omantene haimete opavave tekove ko yvy ape ári, ha oreko tuicha potencial biotecnología solar-pe guarã. Omotenondévo fotosíntesis global, umi bacteria fototrófica púrpura ohechauka avei opáichagua modo energético ha capacidad metabólica. Ikatu ojehekýi fotosíntesisgui ha okakuaa bacteria heterotrófica ramo pytũmbýpe, ikatu omyatyrõ nitrógeno ha dióxido de carbono, ojapo hidrógeno ha ombyai umi compuesto aromático (1-3). Ikatu haguãicha oñeme'ẽ energía ko'ã proceso-pe guarã, pya'e ha hekopete oñekonverti va'erã tesape energía química-pe. Ko proceso oñepyrü complejo antena otrampa tesape oabsorve jave tesape ha ombohasa energía atrapado centro de reacción (RC), upéicha oñepyrü separación carga (4 – 7). Pe unidad básica fotosíntesis rehegua umi bacteria fototrófica púrpura-pe ojejapo RC tipo 2 rehe, ojeréva complejo cosecha de luz 1 (LH1) rehe, omoheñóiva complejo núcleo RC-LH1. LH1 ojejapo peteĩ matriz heterodímero αβ curvo rehegua rupive, peteĩteĩva ojoaju mokõi molécula clorofila bacteriana (BChl) a ha peteĩ térã mokõi carotenoide (8-12). Pe antena LH1 isensíllova oguereko 16 térã 17 heterodímero αβ ojeréva RC (9-13) rehe peteĩ bucle oñembotývape, ha katu ambue complejo núcleo-pe, umi péptido transmembrana ointerrumpi continuidad LH1 ijerére , Péicha omokyre'ỹ difusión quinol/quinona RC ha complejo citocromo bc1 apytépe (11, 13-15 -pe. Pe ka'avo fototrófico púrpura Rhodopseudomonas (Rps.) ha'e peteĩ organismo modelo ikatúva oikuaa energía ha electron ñembohasa oipytyvõva fotosíntesis. Peteĩha estructura cristalina Rps. Pe modelo complejo palustris RC-LH1 rehegua ha e RC, ojeréva 15 bucle heterodimérico LH1 rehe, oñeinterrumpíva peteĩ proteína ndojekuaáiva hérava “Proteína W” (14). Upe rire ojekuaa proteína-W ha'eha RPA4402, ha'éva peteî proteína 10,5kDa noñekarakterisáiva orekóva mbohapy hélices transmembrana (TMH) ojepredikáva ( 16 ). Ropropone oñembohéra jey haguã gen rpa4402 ocodigáva proteína W pufW-pe ojoaju haguã nomenclatura ojeporúva umi genes ocodigáva subunidad RC-L, M (pufL, pufM) ha LH1α, β (pufA, pufB). Iporã jaikuaa, proteína-W oĩ 10% rupinte RC-LH1-pe, ojekuaa Rps. palustris ojapo mokõi complejo RC-LH1 iñambuéva. Ko ápe, romombe u umi estructura crio-EM (crio-EM) resolución yvate mokõi complejo núcleo rehegua, peteĩva oguerekóva proteína W ha 14 heterodímero αβ, ambue katu ndorekóiva proteína W ha peteĩ bucle 16 Heterodímero LH1 oñembotýva. Ore estructura orrepresenta peteĩ cambio paso rehegua oñentende haguã complejo RC-LH1 Rps rehegua. palustris, roanalisa haguére población homogénea peteîteî variante ha roguerekógui resolución suficiente roasigna haguã hesakã porã peteîteî péptido ha pigmento ojoajúva ha lípido ha quinona ojoajúva. Oñembojojávo ko'ã estructura ohechauka umi mbohapy proteína TMH-W ndojejuhúiva ambue complejo RC-LH1 ko'ágã peve omoheñói canal de quinona ombopya'e haguã intercambio quinona/quinolona. Ojekuaa heta tenda ojoajuhápe lípido ha quinona oñeñongatúva, ha roikuaauka peteĩ cambio conformacional pyahu oñembojoaju rire quinona ha RC, ikatúva oĩ porã fotosistema II (PSII) RC umi organismo fototrófico oxigenado-pe g̃uarã. Ore mba’e ojuhúva ome’ẽ jesareko pyahu cinética quinona/quinolona jejopy ha intercambio rehegua complejo núcleo RC-LH1 bacteria fototrófica púrpura-pe.
Ikatu haguã oñemotenonde estudio detallado umi mokõi complejo ojejuhúva Rps. palustris, roipe’a peteĩteĩ RC-LH1 umi método bioquímico rupive. Pe complejo proteína W-deficiente (ko águi rire oñembohérava ΔpufW) oñembopoty pe cepa ndorekóivagui pe gen pufW ( 16 ), ha peteĩ complejo RC-LH1 añoite ikatu ojejapo. Pe complejo oguerekóva proteína W ojejapo peteĩ cepa rupive. Pe proteína W ko cepa rehegua oñemoambue peteĩ etiqueta His 10x reheve iterminal C-pe, ikatu haguãicha pe complejo oguerekóva proteína W oñembojoaju porã proteína W ofaltáva hetave ndive oñeinmoviliza rupi metal. Pe complejo ojesepara efectivamente (16) Cromatografía de Afinidad (IMAC).
Ohechaukaháicha ta anga 1-pe, mokôive complejo oguereko petet RC mbohapy subunidad (RC-L, RC-M ha RC-H) ojeréva petet antena LH1 rehe. Pe estructura 2,80-A complejo ndorekóiva proteína-W ohechauka 16 heterodímero αβ, omoheñóiva peteĩ bucle LH1 oñembotýva ojeréva completamente RC rehe, ko'águi rire oñembohérava complejo RC-LH116. Pe estructura 2,65Å complejo oguerekóva proteína-W oguereko peteĩ LH1 14 heterodímero rehegua oñeinterrumpíva proteína-W rupive, ko’águi rire oñembohérava RC-LH114-W.
(A ha B) Representación superficial compuesto rehegua. (C ha D) Pigmento ojoajúva ojehechaukáva varilla-pe. (E ha F) Umi complejo ojehecháva superficie citoplasmática guive oguereko umi péptido ha subunidad LH1 ojehechaukáva caricatura-pe, ha oñenumera reloj gotyo pe brecha proteína-W guive [ojoajúva numeración Rba rehe. complejo esferoides rehegua (13)]. LH1-α-pe guarã, pe subunidad proteica sa'y ha'e hovy; LH1-β-pe guarã, pe subunidad proteica sa'y hovy; proteína-W-pe guarã, pe proteína pytã; RC-H-pe guarã, ha’e cian; RC-L-pe guarã, ha’e Naranja; RC-M-pe guarã, magenta. Umi cofactor ojehechauka varilla rupive, verde ohechauka molécula BChl ha BPh a, púrpura ohechauka carotenoide ha hovy ohechauka molécula UQ10. (G ha H) Visión magnificada pe brecha proteína-W rehegua oĩva región equivalente complejo RC-LH114-W (G) ha complejo RC-LH116 (H)-pe. Umi cofactor ojehechauka en forma de relleno de espacio, quinona quelado ojehechauka hovy. Pe brecha proteína-W ojehechauka peteĩ línea discontinua hovy rupive (G)-pe, ha umi agujero michĩva oñemyasãihápe quinona/quinolol anillo LH116-pe ojehechauka peteĩ línea discontinua morotĩ rupive (H)-pe.
Figura 1 (A ha B) ohechauka RC ojeréva matriz abierto téra oñembotýva heterodímero LH1αβ rehe, petettet ojoaju mokôi BChl ha petet carotenoide rehe (Ta anga 1, C ha D). Umi estudio ojejapo va’ekue ymave ohechauka Rps ha’eha pe complejo LH1. Pe tape biosintético espirulina xantina rehegua, ko’ã especie oguereko población mixta carotenoides rehegua ( 17 ). Ha katu espiropirroxantina ha’e pe carotenoide dominante ha idensidad ha’e satisfactoria. Upévare, roiporavo romodela haguã espiroxantina opaite LH1 ojoajuhápe. Umi polipéptido alfa ha beta ha e TMH petettet oguerekóva región okápe membrana mbyky (Ta anga 1, A, B, E ha F). Jepémo ndojehechái densidad 17 residuo C-terminal-pe, polipéptido alfa ojeipe a Met1 guive Ala46 peve mokõive complejo-pe. Polipéptido β oñemboguejy Gly4 guive Tyr52 peve RC-LH116-pe, ha Ser5 guive Tyr52 peve RC-LH114-W-pe. Ndojehechái densidad 3 térã 4 residuo N-terminal térã 13 C-terminal (Figura S1). Análisis espectrometría de masas complejo RC-LH1 mixto oñembosako'íva cepa de tipo silvestre-gui ohechauka región ofaltáva ha'eha resultado escisión heteróloga ko'ã péptido (Figura S1 ha S2). Ojehechakuaa avei pe formulación N-terminal α-Met1 rehegua (f). Pe análisis ohechauka pe α-péptido oguerekoha residuo fMet1 guive Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 peve, ha pe β-péptido oguerekoha residuo Ser2 guive Ala53 peve, oîva de acuerdo porã pe mapa de densidad EM temperatura baja rehegua ndive.
Pe coordinación α-His29 ha β-His36 rehegua ojapo BChls hovake; petettet heterodímero αβ oñembyaty ivesínokuéra ndive ojapo hagua petet bucle abierto (RC-LH114-W) téra petet bucle cerrado (RC-LH116) RC jerére Pe matriz de pigmentos acoplado excitón rehegua (Ta anga 1, C ha D). Oñembojojávo banda 877 nm RC-LH114-W rehe, pe desplazamiento rojo absorción 880 nm RC-LH116 rehegua ha e 3 nm (Ta anga 2A). Ha katu pe espectro dicroismo circular rehegua haimete ojoguaite (Ta anga 2B), ohechaukáva jepémo ojoavy hesakã porã umi bucle abierto ha oñembotýva apytépe, ojoguaiterei pe ambiente local BChls rehegua. Pe desplazamiento rojo absorción rehegua ikatu ha e pe resultado movimiento térmico oñemboguejýva ha estabilidad ojupíva pe bucle oñembotýva rehe (18, 19), pe cambio acoplamiento pigmento rehegua ojejapóva pe bucle oñembotýva rupive (20, 21), térã peteĩ combinación ko a mokõi efecto rehegua (11).
(A) Espectro de absorción ultravioleta/visible/infrarrojo cercano, umi pico oñemarkáva umi pigmento correspondiente reheve ha oñenormalisáva pico BPh-pe 775 nm-pe. (B) Espectro dicroismo circular oñenormalisáva absorbancia BChl-pe 805 nm-pe. (C ha D) Ojeporavóva espectro ΔA umi espectro absorción tiempo-resolvido complejo RC-LH114-W (C) ha complejo RC-LH116 (D)-gui. Oñembojoja porãve hagua, opaite espectro oñenormalisáva ∆A −A-pe 0,2 ps-pe. (E) Pe tasa oxidación citocromo c2 rehegua irradiación rire oî jave opaichagua concentración UQ2 rehegua (ehecha ta anga S8 dato bruto rehegua). (F) Umi célula okakuaáva tesape baja, mediana térã alta intensidad guýpe (10, 30 térã 300μMm-2 s-1, respectivamente), umi subunidad proteína W ha RC-L complejo purificado-pe ha pe relación membrana separada-pe. Ojekuaa nivel proteico electroforesis gel SDS-poliacrilamida rupive ha inmunoensayo rupive (ehecha ta anga S9 dato bruto rehegua). Ojekuaa pe relación relativa pe complejo RC-LH114-W purificado rehe. Pe relación estequiométrica RC-L ha proteína-W complejo rehegua ha e 1:1.
Umi BChls oíva posición 1-pe pe bucle αβ14 deformado RC-LH114-W-pe (Ta anga 1, A, C ha E) hi aguivéma pe donante primario RC (P)-gui 6,8Å umi BChls equivalente RC-LH116-peguágui (Ta anga 1, B, D, ha F, ha Figura S3); jepémo upéicha, cinética absorción transitoria rehegua umi mokôi complejo rehegua ohechauka RC-LH114-W ha RC-LH116-pe guarâ, umi constante tiempo transferencia energía excitación rehegua LH1 guive RC peve ha e 40 ±4 ha 44±3 ps (Ta anga 2). , C ha D, Ta anga S4 ha Cuadro S2). Avei ndaipóri diferencia significativa transferencia electrónica RC ryepýpe (Figura S5 ha texto suplementario ojoajúva). Rosospecha pe correspondencia estrecha pe tiempo transferencia energía rehegua LH1 ha RC-P apytépe ojehuha pe distancia, ángulo ha energía potencial ojoguáva la mayoría BChl-pe umi mokõi bucle LH1-pe. Ha'ete ku ojehesa'ÿijóvo patrón energía LH1 ohupyty haguã distancia mínima ndaha'éi pya'eve transferencia directa energía umi sitio subóptimo RC-pe. Pe bucle LH1 bucle abierto RC-LH114-W-pe ikatu avei ohasa movimiento térmico insignificante condición temperatura baja-pe análisis estructural-pe guarã, ha oî conformación anillo αβ14 ipukuvéva temperatura ambiente-pe distancia pigmentación βBChls posición RC 1-pe.
Pe complejo RC-LH116 oguereko 32 BChls ha 16 carotenoides, ha iñemohenda tuichakue ojoguaite pe ojehupytýva Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 cepa ( PDB ID 7C9R) (12) ha verde-gui alga (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) rehegua. Ojejapo rire alineación, ojehechakuaa desviación michĩmínte umi heterodímero αβ ñemohendahápe, ko ýte 1-5, 15 ha 16 (Ta anga S6). Oĩramo proteína-W oguereko tuicha impacto LH1 estructura rehe. Mbohapy TMH orekóva ojoaju bucle mbyky rupive, N-terminal oíva lumen lado complejo ha C-terminal lado citoplasmático (Ta anga 1A ha 3, A guive D peve). Proteína-W tuicha hidrofóbica (Ta anga 3B), ha TMH2 ha TMH3 oñembojoaju LH1αβ-14 ndive ojapo hagua petet superficie transmembrana (Ta anga 3, B ha E guive G peve). Pe interfaz ojejapo principalmente umi residuo Phe, Leu ha Val rehegua oĩva región transmembrana-pe. Ko'ã residuo oñembojehe'a aminoácido hidrofóbico ha pigmento αβ-14 rehe. Oĩ avei residuo polar oipytyvõva pe interacción, umíva apytépe pe enlace hidrógeno W-Thr68 ha β-Trp42 apytépe pe cavidad compleja superficie rehe (Ta anga 3, F ha G). Citoplasma ári, Gln34 ojoaju pe grupo ceto carotenoides αβ-14 rehe. Avei, ojeresolve pe molécula n-dodecil β-d-maltósido (β-DDM), ha ikuã hidrofóbico ojepyso pe interfaz proteína-W ha αβ-14 apytépe, ha pe lípido jyva ikatu oĩ hetepýpe. Avei rohechakuaa umi región resolución C-terminal proteína W ha RCH rehegua hi aguietereiha, ha katu ndaha éi pe ámbito ryepýpe oñeforma hagua interacción específica (Figura 1, A ha E). Ha katu ikatu oî interacción umi aminoácido C-terminal noñesolucionáivape ko'ã mokôi proteína rehegua, ikatúva ome'ê peteî mecanismo oñecontrata haguã proteína-W oñembyaty jave complejo RC-LH114-W.
(A) Proteína-W, ombohováiva interfaz LH1αβ14 ndive forma de dibujos animados-pe, oguereko peteĩ cadena lateral orekóva forma de varilla (pytã), ojehechaukáva peteĩ parte diagrama potencial electrostático-pe (superficie gris transparente orekóva nivel de contorno 0,13). (B) Proteína-W ojehechaukáva petet superficie color hidrofóbica rupive. Umi área polar ha cargada ojehechauka cian-pe, umi área hidrofóbica ojehechauka morotĩme ha umi área hidrofóbica mbarete ojehechauka naranja-pe. (C ha D) Proteína-W ojehechaukáva caricatura-pe, iorientación ojoguaite (A) (C)-peguáicha, ha ojere 180° (D). Según pe posición oíva secuenciape, umi residuo ojedistinguíva oadopta petet esquema de color arco iris, upépe pe N-terminal hovy ha pe C-terminal ha e pytã. (E) Proteína-W ojehechaháicha (A)-pe, ha umi residuo oíva interfaz proteína-W:LH1 rehegua ojehechauka varilla oguerekóva marca oñembojoajúva rupive. (F) Proteína-W ojere 90° (E) ha LH1αβ14 rehe pe representación caricatura-pe, ha umi residuo interfaz rehegua rehe pe barra representación-pe. Umi residuo ojeipysóva polipéptido beta-gui oñembohéra. Pe cofactor ojehechauka barra ramo ojoajúva ta anga 1 color rehe, pe β-DDM oñedescompuesto ojehechauka gris-pe, ha oxígeno ojehechauka pytãme. (G) Pe ojehecháva (F)-pe ojere 180°, umi residuo ojehecharamóva polipéptido alfa etiquetado reheve.
Proteína-W omyengovia peteĩ heterodímero αβ (pe 15ha ta anga 1F-pe), upéicha rupi ojoko bucle ñemboty ha oñeinclina mbohapy heterodímero αβ tenondegua. Ojehechakuaa pe ángulo máximo de inclinación heterodímero αβ-1 peteĩha rehegua pe película normal rehegua ha e 25° guive 29° peve (Ta anga 1, A ha E), oñeformava ekue pe inclinación 2° a 8° αβ-1 rehegua RC A contraste-LH116-pe (Ta anga 1, B ha F). Mokõiha ha mbohapyha heterodímero oñeinclina 12° guive 22° peve ha 5° guive 10° peve, petettet. Pe obstáculo estérico RC rehegua rupi, pe inclinación αβ-1 rehegua ndoikéiva mokõiha par αβ (okorrespondéva 16ha αβ ta anga 1F-pe), upéicha rupi ojejapo peteĩ brecha hesakãva anillo LH1-pe (Ta anga 1, A ha E) . Ndaipórigui mokõi heterodímero αβ, omoirûva pérdida irundy BChl ha mokõi carotenoide, ni peteîva umi carotenoide ndojoajúi subunidad αβ-1 retorcida rehe, upévagui peteî anillo LH114-W oguerekóva 13 carotenoide Vegetariano ha 28 BChls. Umi estimación resolución local umi mokõi complejo región αβ1 guive 7 peve imbovyve umi ambue bucle LH1-gui, ikatúva ohechauka plasticidad inherente subunidad LH1 ojoajúva RC QB tenda rehe (Ta anga 4) .
Umi ta anga RC-LH114-W (A ha B) ha RC-LH116 (C ha D) rehegua ojehechauka petetchagua jehecha yvate guive/lado gotyo (A ha B) (A ha C) ha superficie cavidad rehegua Fig. 1. (B ha D). Umi tecla colorada ojehechauka derecha gotyo.
Peteĩnte ambue complejo núcleo característica orekóva relación estequiométrica 1:14 ha'e pe dímero Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Ha katu, proteína W ha PufX ndorekói homología ojehechakuaáva, ha oguereko tuicha impacto umi estructura LH1 rehegua. PufX ha e petet TMH añoite oguerekóva petet dominio citoplasmático N-terminal oñembojoajúva lado citoplasmático subunidad RC-H (13) ndive petet posición okorrespondéva Rps-pe. palustris LH116αβ-16 rehegua. PufX omoheñói peteĩ canal intercambio quinona/quinolona rehegua RC-LH1 ha complejo citocromo bcl apytépe ha oĩ opaite Rba-pe. complejo núcleo esfaeroides rehegua (13). Jepémo pe interfaz monómero-monómero oĩ Rba-pe. Umi dímero esferoides RC-LH1-PufX oñemohenda posición de unión proteína W RC-LH114-W-pe, ha pe brecha omoheñóiva PufX ha proteína-W oime posición equivalente-pe (Figura S7A). Pe brecha RC-LH114-W-pe oñemohenda avei hipotético canal de quinona (8) Pseudomonas rosea LH1 rehegua ndive, ojejapóva péptido ndojoajúiva proteína W térã PufX rehe (Figura S7B). Avei, canal de quinona oîva Blc. Pe LH1 verde esmeralda ojejapóva oñemboykévo peteĩ subunidad γ (7) oñemohenda peteĩ tenda ojoguávape (Ta anga S7C). Jepémo oñemombyte opaichagua proteína, ojehecha ko ã canal quinona/quinolol peteĩ posición común complejo RC-LH1-pe ha e peteĩ techapyrã evolución convergente rehegua, ohechaukáva pe brecha omoheñóiva proteína W ikatuha oactua peteĩ canal quinona ramo.
Pe brecha oíva bucle LH114-W-pe oheja oñeforma petet región membrana continua espacio interno complejo RC-LH114-W ha membrana a granel apytépe (Figura 1G), ombojoaju rangue umi mokôi dominio petet poro proteico rupive proteína-peguáicha. Pe complejo RC-LH116 ojogua peteĩ Tch oñembotývape. Complejo ojoguáva aguja-pe (22) (Ta anga 1H). Pe quinona difusión membrana rupive pya evégui pe difusión canal proteico estrecho rupive, pe bucle LH114-W abierto ikatu oheja pya eve RC rotación pe bucle LH116 oñembotývagui, ha pe difusión quinona rehegua RC-pe ikatu ojejokove. Ikatu haguã ojehecha proteína W ohypýipa pe conversión quinona rehegua RC rupive, rojapo peteĩ ensayo de oxidación citocromo rehegua peteĩ concentración determinada ubiquinona 2 (UQ2) rehe (peteĩ análogo UQ10 natural rehegua orekóva peteĩ cola isopreno mbykyvéva) (Figura 2E). Jepémo oîha quinona quelada ohapejoko determinación exacta constante Michaelis ojehecháva (RC-LH114-W ha RC-LH116 oî porã 0,2±0,1μM ha 0,5±0,2μM, respectivamente), tasa máxima RC-LH114-W ( 4,6±0,2 e-RC-1 s-1) ha'e 28±5% tuichave RC-LH116-gui (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Roestima iñepyrũrã proteína-W oĩha 10% rupi pe complejo núcleo-pe ( 16 ); ko ápe, umi tasa de ocupación umi célula okakuaaha tesape michĩva, tesape media ha tesape yvate ha e 15±0,6%, 11±1% ha 0,9±0,5, petettet % (Ta anga 2F). Oñembojojávo cuantitativo espectrometría de masas ohechauka oñembojoapývo etiqueta histidina nomboguejýi abundancia relativa proteína-W oñembojojávo cepas de tipo silvestre (P = 0,59), upéicha ko'ã nivel ndaha'éi artefacto proteína-W modificada (Figura S10). Ha katu ko ocupación michĩva proteína-W rehegua complejo RC-LH1-pe ikatu oheja oĩ RC ojere peteĩ ritmo acelerado-pe, upéicha omomichĩ pe intercambio mbeguevéva quinona/quinolona complejo RC-LH116-pe. Rohechakuaa pe tasa de ocupación tesape yvate ndojoajúiha umi dato transcriptómica nda’aréi ojejapóva ndive, ohechaukáva expresión génica pufW ojupiha tesape mbarete guýpe (Figura S11) (23). Pe diferencia oîva transcripción pufW ha incorporación proteína-W complejo RC-LH1-pe ha'e confuso ha ikatu ohechauka regulación compleja proteína rehegua.
RC-LH114-W-pe oñeme e ha oñemodela ipype 6 cardiolipina (CDL), 7 fosfatidilcolina (POPC), 1 fosfatidilglicerol (POPG) ha 29 molécula β-DDM 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG ha 12 βDDM. RC-LH116 (Ta anga 5, A ha B). Ko ã mokõi estructura-pe, CDL haimete oñemohenda lado citoplasmático complejo-pe, ha katu POPC, POPG ha β-DDM oñemohenda hetave lado luminal-pe. Mokõi molécula lípido ha detergente ojeipe a pe región αβ-1 guive αβ-6 peve complejo RC-LH114-W-pe (Ta anga 5A), ha cinco ojeipe a pe región equivalente RC-LH116-pe (Ta anga 5B). Ojejuhu hetave lípido ambue lado complejo-pe, principalmente CDL, oñembyatýva RC ha αβ-7 mbytépe αβ-13 peve (Ta anga 5, A ha B). Ambue lípido ha detergente estructuralmente ojerresolvéva oñemohenda anillo LH1 okaháre, ha umi cadena acil ojerresolvéva ojepyso umi subunidad LH1 apytépe, tentativamente oñembohéra β-DDM ramo RC-LH114-W-pe, ha ojedefini β-DDM ramo RC-pe A mezcla β-DDM ha POPC-LH116-pe. Umi posición ojoguáva lípido ha detergente quelante ñande estructura-pe ohechauka ha eha umi sitio de unión fisiológicamente relevante (Figura S12A). Umi posición molécula equivalente rehegua Tch-pe oguereko avei consistencia porã. Manso ha Trv. Cepa 970 RC-LH1s (Figura S12, B a E) (9, 12) ha umi residuo ojoajúva hidrógeno rehe pe grupo iñakã lípido rehegua ohechauka conservación bastante iporãva alineación secuencia-pe (Figura S13), ohechaukáva CDL Conservado ojoajúva RC rehe (24), ko'ã sitio ikatu oñeñongatu complejo RC-LH1-pe.
(A ha B) Umi péptido RC-LH114-W (A) ha RC-LH116 (B) ojehechauka caricatura rupive, ha umi pigmento ojehechauka varilla rupive, ojeporúvo esquema de color ta anga 1. Umi lípido ojehechauka pytãme, ha umi detergente ojehechauka grispe. UQ ojoajúva RC QA ha QB tenda rehe hovy, UQ aislado katu hovy. (C ha D) Ojoguaite (A) ha (B), ojehejareívo lípido. (E guive G peve) Ojehecha tuichavéva Q1(E), Q2(F) ha Q3(G) RC-LH116 guive, oguerekóva cadena lateral oinfluíva ojuehe. Umi enlace hidrógeno rehegua ojehechauka línea discontinua morotîicha.
RC-LH116-pe, mokõive RC QA ha QB UQ, oparticipáva transferencia de electrones-pe proceso de separación carga-pe, oñedescompone umi sitio de unión-pe. Ha katu RC-LH114-W-pe, QB quinona noñesolucionái ha oñeñe ẽta hese detalle reheve ko ápe. Oĩve umi quinona QA ha QB, mokõi molécula UQ quelado (oĩva anillo RC ha LH1 mbytépe) oñembojaꞌo estructura RC-LH114-W-pe según umi grupo iñakã rehegua ojeresolve porãva (oĩva Q1 ha Q2-pe, peteĩteĩ). pa'ũ). Figura 5C rehegua). Mokõi unidad isopreno rehegua oñeasigna Q1-pe, ha pe mapa densidad rehegua osoluciona umi 10 isopreno cola completa Q2 rehegua. RC-LH116 estructurape, ojeresolve mbohapy molécula UQ10 quelado (Q1 guive Q3 peve, Figura 5D), ha opaite molécula oguereko densidad hesakãva cola pukukue (Ta anga 5, D guive G peve). Umi mokõi estructura-pe, umi posición umi grupo iñakã quinona rehegua Q1 ha Q2-pegua oguereko consistencia iporãitereíva (Figura S12F), ha oñembojoaju RC ndive añoite. Q1 oñemohenda RC-LH114-W brecha W ojeikehápe (Ta anga 1G ha 5, C, D ha E), ha Q2 oñemohenda QB ojoajuhágui (Ta anga 5, C, D) ha F). Umi residuo L-Trp143 ha L-Trp269 oñeñongatúva hi aguieterei Q1 ha Q2-gui ha ome e interacción potencial π-apilamiento rehegua (Ta anga 5, E ha F, ha ta anga S12). L-Gln88, 3,0 Å oxígeno distal Q1-gui, ome e petet enlace hidrógeno mbarete (Ta anga 5E); ko residuo oñeñongatu opaite RC-pe ndaha éiramo pe relación mombyryvéva (Ta anga S13). L-Ser91 oñesustitui conservadormente Thr rehe hetave ambue RC-pe (Ta anga S13), ha e 3,8 Angstrom oxígeno metilo Q1-gui, ha ikatu ome e enlace hidrógeno ikangyva (Ta anga 5E). Q3 ndojehechái oguerekoha petet interacción específica, ha katu oñemohenda región hidrofóbica-pe subunidad RC-M ha subunidad LH1-α 5 guive 6 peve (Ta anga 5, D ha G). Avei ojeresolve Q1, Q2 ha Q3 térã quinona quelado hi’aguĩva Tch. Manso, Trv. Cepa 970 ha Blc. Pe estructura iris rehegua (9, 10, 12) ohechauka petet sitio de unión quinona auxiliar oñeñongatúva complejo RC-LH1-pe (Figura S12G). Umi po UQ descompuesto RC-LH116-pe oî porã 5,8±0,7 peteîteî complejo ojedetermináva cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) rupive, ha katu umi mbohapy UQ descompuesto RC-LH114-W-pe imbovyve Pe valor medido 6,2±0,3 (Fig. S14) ohechauka oîha molécula UQ noñesolucionáiva estructura-pe.
Umi polipéptido L ha M seudosimétrico peteĩteĩ oguereko po TMH ha ojapo peteĩ heterodímero ombojoajúva peteĩ dímero BChl, mokõi monómero BChl, mokõi monómero bacteriófago (BPh) ha peteĩ hierro ndaha éiva Heme ha peteĩ térã mokõi molécula UQ10. Oĩ rupi enlace hidrógeno grupo cetona terminal rehe ha ojekuaáva acumulación orekóva Rps-pe, carotenoides oñemoinge subunidad M-pe, oñembohérava cis-3,4-deshidroorhodopina. Especie (25) rehegua. Pe dominio membrana okapegua RC-H rehegua oñeancla pe membrana rehe petet TMH rupive. Pe RC estructura tuichakue ojogua umi mbohapy subunidad RC umi especie ojoajúva rehe (ha eháicha Rba). esferoides (ID PDB: 3I4D) rehegua. Umi macrociclo BChl ha BPh, columna vertebral carotenoide ha hierro ndaha éiva heme oñesuperpone rango resolución ryepýpe ko ã estructura-pe, ojapoháicha grupo iñakã UQ10 QA tenda ha QB quinona RC-LH116 (Ta anga S15).
Ojeguereko mokõi estructura RC orekóva tasa de ocupación sitio QB iñambuéva ome'ë oportunidad pyahu ohesa'ÿijo haguã umi cambio conformacional consistente omoirüva unión quinona QB. Pe complejo RC-LH116-pe, quinona QB oñemohenda pe posición “proximal” oñembojoaju porãvape ( 26 ), ha katu pe separación RC-LH114-W rehegua ndorekói quinona QB. Ndaipóri quinona QB RC-LH114-W-pe, upéva ñanesorprende pe complejo oîgui activo, hetave pe complejo RC-LH116 orekóva quinona QB estructuralmente resolución. Jepémo umi mokõi anillo LH1 oquela seis quinona rupi, cinco ojeresolve estructuralmente pe anillo RC-LH116 oñembotývape, mbohapynte katu estructuralmente limitado pe anillo RC-LH114-W abierto-pe . Ko trastorno estructural ojupíva ikatu ohechauka oñemyengovia pya'eveha umi sitio QB RC-LH114-W, cinética quinona pya'eve complejo-pe, ha oñembohetave posibilidad ojehasávo bucle LH1. Ro’e pe falta de UQ pe RC QB tenda RC-LH114-W-pe ikatuha ha’e peteĩ complejo complejo ha activovéva resultado, ha pe QB tenda RC-LH114-W-pegua oñecongela pya’e pe UQ rotación-pe Pe etapa específica (oñemboty pe jeike QB tendape) ohechauka pe conformación ko actividad rehegua.
QB ÿre, pe rotación omoirûva L-Phe217 peteî posición incompatible UQ10 jejopy ndive, omoheñóitagui peteî choque espacial peteîha unidad isopreno cola rehegua ndive (Figura 6A). Avei, ojehechakuaa umi cambio conformacional principal ojehechakuaáva, especialmente hélice de (hélice mbykymi oĩva bucle TMH D ha E mbytépe) oñembohasahápe L-Phe217 bolsillo de unión QB-pe ha rotación L-Tyr223-pe (Figura 6A ) Oñembyai haguã enlace hidrógeno marco M-Asp45 ndive ha oñemboty haguã entrada sitio de unión QB (Ta’anga 6B) rehegua. Hélice de pivota ibase-pe, Cα L-Ser209 rehegua oñembohasa 0,33Å, ha L-Val221Cα katu oñembohasa 3,52Å. Ndaipóri cambio ojehechakuaáva TMH D ha E-pe, ha e superponible mokõive estructura-pe (Ta anga 6A). Jaikuaaháicha, kóva ha e petet estructura RC natural-pe ombotýva QB tenda. Oñembojojávo estructura completa (QB-pe oñembojoajúva) rehe ohechauka oñemboguejy mboyve quinona, oñeikotevẽha peteĩ cambio conformacional oike haguã quinona-pe. L-Phe217 ojere ojapo hagua petet interacción π-apilamiento rehegua pe grupo akã quinona rehegua ndive, ha pe hélice oñembohasa okápe, upéicha rupi pe esqueleto L-Gly222 ha cadena lateral L-Tyr223 rehegua ojapo petet red enlace hidrógeno rehegua oguerekóva estructura enlace hidrógeno rehegua estable (Ta anga 6, A ha C).
(A) Caricatura oñembojoajúva holograma (cadena L, cadena naranja/M, magenta) ha estructura apo (gris) rehegua, ojehechaukahápe umi residuo clave peteĩ representación ojoguáva varilla-pe. UQ10 ojehechauka peteĩ barra hovy rupive. Pe línea punteada ohechauka umi enlace hidrógeno rehegua oñeformava ekue pe estructura tuichakue javeve. (B ha C) Pe representación superficial apolipoproteína ha estructura anillo pukukue rehegua, ohechaukáva oxígeno cadena lateral L-Phe217 hovy ha L-Tyr223 pytãme, petettet. Pe subunidad L ha’e naranja; umi subunidad M ha H ndoguerekói color. (D ha E) Apolipoproteína (D) ha entero (E) RC QB tenda [color por (A) respectivamente] ha Thermophilus thermophilus PSII (verde, hovy quinona plástica reheve; PDB ID: 3WU2) Oñemohenda (58).
Oñeha’arõ’ỹre, jepémo ojeguereko heta estructura umi RC deficiente QB-gui ndorekóiva LH1, umi cambio conformacional ojehecháva ko estudio-pe noñemombe’úikuri yma. Ko'ãva apytépe oime estructura de depleción QB oúva Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Tch. Ñe’ẽpoty ha ñe’ẽpoty ñemohenda. tepidum (ID PDB: 1EYS) (28) ha Rba. esfaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), opavave haimete ojoguaite pe estructura QB general orekóva ndive. Ojehechávo porã 3PRC ojekuaa umi molécula detergente LDAO (Óxido de Dimetil Amina) ojoaju oikehápe posición QB, ikatúva ojoko reordenamiento conformación oñembotývape. Jepémo LDAO ndojedescomponéi peteĩchagua tenda 1EYS térã 1OGV-pe, ko ã RC oñembosako i ojeporúvo peteĩchagua detergente ha upévare ikatu ojapo peteĩchagua efecto. Pe estructura cristalina Rba rehegua. Sphaeroides RC oñecocristalizava citocromo c2 ndive (PDB ID: 1L9B) ha’ete avei oguerekóva peteĩ QB tenda oñembotýva. Ha katu, ko kásope, pe región N-terminal polipéptido RC-M rehegua (ointeractúa pe sitio de unión QB ndive pe enlace H rupive pe residuo Tyr rehegua pe hélice Q-pe) oadopta peteĩ conformación ndaha éiva natural, ha pe cambio conformacional QB rehegua noñehesa ỹijovéi ( 30 ). Pe ñanembopy'aguapýva ha'e ndajahechái ko'ãichagua deformación polipéptido M estructura RC-LH114-W-pe, haimete ojoajúva región N-terminal RC-LH116 RC-pe. Avei ojehechakuaava era oñemboyke rire pe antena LH1 basada detergente rehegua, ojeresolve hague umi RC apolipoproteína oíva PDB-pe, omboykéva umi piscina quinona interna ha lípido oîva brecha oîva RC ha superficie hyepypegua anillo LH1 ijeréregua apytépe (31, 32). RC opyta funcional oguerekógui opaite cofactor, ndaha éiramo pe quinona QB descomponible, sa ive estable ha okañy jepi proceso de preparación aja (33). Avei, ojekuaa ojeipe ávo LH1 ha lípido cíclico natural RC-gui ikatuha oreko impacto umi función rehe, ha eháicha pe vida útil oñembotapykuéva estado P+QB ojeseparáva carga rupive ( 31 , 34 , 35 ). Upévare, ro’espekula oĩha pe anillo LH1 local ojeréva RC rehe ikatuha omantene pe sitio QB “oñembotýva”, upéicha oñeñongatu pe ambiente local hi’aguĩva QB-gui.
Jepémo apolipoproteína (quinona QB ÿre) ha estructura completa ohechauka mokôi instantánea añónte pe rotación QB tenda rehegua, ndaha éi peteî serie de eventos, oî indicio ikatuha oñemboty pe unión ani haguã ojoaju jey hidroquinona rupive Ojejoko haguã inhibición sustrato rehegua. Pe interacción quinolol ha quinona hi’aguĩva apolipoproteína QB rendaguégui ikatu iñambue, upéva ogueru ombotovévo chupe RC rupive. Ymaite guive oje'e umi cambio conformacional oguerekoha peteî rol ojoaju ha oñemboguejy haguã quinonas. Oñembyai pe capacidad orekóva umi RC congelado omboguejy haguã quinonas adaptación iñypytû rire (36); Cristalografía de rayos X ohechauka ko daño ojehuha umi quinona QB oñeñapytĩgui peteĩ conformación “distal”-pe amo 4,5 Å rupi pe posición proximal activa-gui (26) , 37). Ro’e ko conformación de unión distal ha’eha peteĩ instantánea estado intermedio apolipoproteína ha estructura anillo completo apytépe, oúva interacción ñepyrũrã quinona ndive ha apertura sitio QB.
Pe RC tipo II ojejuhúva complejo PSII-pe ciertas bacterias fototróficas ha cianobacterias, alga ha ka avokuéra oreko conservación estructural ha funcional ( 38 ). Pe alineación estructural ojehechaukáva ta anga 6 (D ha E)-pe omomba e guasu ojoavyha ​​umi RC PSII ha pe sitio QB complejo RC bacteriano rehegua. Ko ñemoha’anga ymaite guive ha’e peteĩ modelo ojestudia haguã umi sistema ojoaju porãva quinona jejopy ha reducción rehegua. Umi publicación ojejapo va’ekue ymave he’i umi cambio conformacional omoirûha reducción PSII quinonas rehegua ( 39 , 40 ). Upévare, ojehechávo conservación evolutiva RC rehegua, ko mecanismo de unión ndojehecháiva’ekue yma ikatu avei ojeporu pe sitio QB PSII RC rehegua umi planta fototrófica oxigenada-pe.
Rps ΔpufW (deleción pufW no etiquetada) ha PufW-His (C-terminal 10x proteína-W etiquetada His ojehechaukáva locus pufW natural-gui) cepas. palustris CGA009 oñemombe’u ore rembiapo mboyveguápe (16). Ko'ã cepa ha túva isogénico tipo silvestre ojerekupera congelador-gui ojejapo jave raya mbovymi célula PYE (cada uno 5 g litro -1) (oñongatúva LB-pe -80 °C-pe, orekóva 50% ( p/v) proteína glicerol), extracto de levadura ha succinato) placa agar [1,5% (p/v)]. Pe chapa oñeincuba pyhare pytũmbýpe temperatura ambiente-pe condición anaeróbica-pe, ha upéi oñehesape tesape morotĩme (~50 μmolm-2 s-1) ome’ẽva umi bombilla halógeno OSRAM 116-W (RS Components, Reino Unido) 3 a 5 ára pukukue ojekuaa peve peteĩ colonia añoite. Ojeporu petet colonia añoite oñeinocula hagua 10 ml medio M22+ (41) oñembohetavéva 0,1% (p/v) ácido casamino reheve (ko águi rire oñembohéra M22). Pe cultura oñemongakuaa condición oxígeno michĩvape pytũmbýpe 34°C-pe oñemboveve 180 rpm-pe 48 aravo aja, ha upéi oñeinocula 70 ml pe cultura umi condición peteĩchaguápe 24 aravo aja. Ojepuru petet cultura semiaeróbica oguerekóva volumen 1 ml oñeinocula hagua 30 ml medio M22 petet botella de vidrio transparente tornillo universal 30 ml-pe ha oñeirradia agitación reheve (~50μmolm-2 s-1) 48 aravo aja fuerza magnética estéril rupive Vara de agitación. Upéi oñeinocula 30 ml cultura 1 litro rupi cultura reheve umi condición-pe, upéi ojeporu oñeinocula hagua 9 litro rupi cultura ohesapéva ~200 μmolm-2 s-1-pe 72 aravo aja. Umi célula oñembyaty centrifugación rupive 7132 RCF-pe 30 minuto aja, oñesuspende jey ~10 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0)-pe, ha oñeñongatu -20°C-pe oñeikotevẽ peve.
Ojedesconge rire, oñembojehe a umi célula oñesuspende jeývape unos kuánto cristal desoxirribonucleasa I (Merck, Reino Unido), lisozima (Merck, Reino Unido) ha mokõi tableta inhibidora proteasa holoenzima Roche rehegua (Merck, Reino Unido). Peteĩ célula de presión francesa 20.000 psi (Aminco, EE.UU.)-pe, oñembyai umi célula 8 térã 12 jey. Ojepe a rire umi célula noñembyaíriva ha umi escombro insoluble centrifugación rupive 18.500 RCF-pe 15 minuto aja 4°C-pe, ojeprecipita pe membrana lisado pigmentado-gui centrifugación rupive 113.000 RCF-pe 2 aravo aja 43.000°C-pe. Ojeity pe fracción soluble ha oñesuspende jey pe membrana colorada 100 a 200 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0)-pe ha oñehomogeneisa ndaipóri peve agregado ojehecháva. Pe membrana suspendida oñeincuba 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, EE.UU.) oguerekóva 2% (p/v) β-DDM 1 aravo aja pytũmbýpe 4°C-pe oñembopupu mbeguekatu jave. Upéi oñecentrifugá 70°C-pe ojedisuelve hagua 150.000 RCF 4°C-pe 1 aravo aja ojeipe a hagua umi insoluble residual.
Pe membrana solubilizante oúva cepa ΔpufW-gui ojejapo petet columna intercambio de iones DEAE Sepharose 50 ml rehe oguerekóva mbohapy volúmen columna (CV) tampón de unión [20 mM tris-HCl (pH 8,0) oguerekóva 0,03% (p / v) β-DDM]. Ojejohéi pe columna mokõi tampón de unión CV reheve, ha upéi ojejohéi pe columna mokõi tampón de unión reheve oguerekóva 50 mM NaCl. Pe complejo RC-LH116 ojeipe a petet gradiente lineal 150 ha 300 mM NaCl reheve (tampón de unión-pe) 1,75 CV-pe, ha pe complejo de unión hembýva ojeipe a petet tampón de unión oguerekóva 300 mM NaCl 0,5 CV-pe. Oñembyaty espectro absorción rehegua 250 ha 1000 nm mbytépe, oñeñongatu pe fracción oguerekóva relación absorbancia (A880/A280) tuichavéva 1gui 880 ha 280 nm-pe, ojedilui mokôi jey tampón de uniónpe, ha ojeporu jey upe procedimiento columna DEAE rehe Purificación rehe. Ojedilui umi fracción oguerekóva relación A880/A280 yvateve 1,7-gui ha umi relación A880/A805 yvateve 3,0-gui, ojejapo mbohapyha ronda intercambio iónico rehegua, ha ojeguereko umi fracción orekóva relación A880/A280 yvateve 2,2-gui ha relación A880/A805 yvateve 5,0-gui. Pe complejo parcialmente purificado oñeconcentra ~2 ml peve peteĩ filtro centrífugo Amicon 100.000 peso molecular corte (MWCO)-pe (Merck, Reino Unido), ha ojekarga peteĩ columna de exclusión tamaño Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) oguerekóva tampón NaCl 200 mM, ha upéi ojejohéi peteĩ tampón-pe 1,5 CV-pe. Oñembyaty umi espectro absorción rehegua fracción exclusión tamaño rehegua, ha oñeconcentra umi espectro absorción rehegua oguerekóva relación A880/A280 2,4 ári ha A880/A805 relación 5,8 ha 100 A880 ári, ha pya e ojepuru oñembosako i téra oñeñongatu hagua rejilla crio-TEM rehegua Oñeñongatu -80°C-pe oñeikoteve peve.
Pe membrana solubilizante oúva cepa PufW-His-gui ojejapo petet columna HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8,0) oguerekóva 200 mM NaCl ha 0,03% (p/p)) tampón IMAC-pe ( GE Healthcare). v) β-DDM rehegua]. Ojejohéi pe columna po CV tampón IMAC reheve, ha upéi po CV tampón IMAC reheve oguerekóva histidina 10 mM. Pe complejo núcleo ojeipe a columnagui po tampón IMAC reheve oguerekóva histidina 100 mM. Pe fracción oguerekóva complejo RC-LH114-W oñeconcentra ~10 ml peve petet tanque oñembopupuva ekue oguerekóva filtro Amicon 100.000 MWCO (Merck, Reino Unido), ojedilui 20 jey tampón de unión reheve, ha upéi oñembojehe a 25 ml peve Pe columna DEAE Sepharose-pe, ojeporu de antemano irundy CV oñembojoajúva tampón rehe. Ojejohéi pe columna irundy tampón de unión CV reheve, upéi ojejohéi pe complejo ocho CV rehe petet gradiente lineal NaCl 0 a 100 mM-pe (tampón de unión-pe), ha umi irundy CV hembýva oguerekóva tampón de unión 100 mM Umi complejo residual ojeeluíva cloruro de sodio rehe oñembojoajúva relación A880/A280 yvateve 2,4 ha pe Oñeconcentra relación A880/A805 yvateve 4,6 fracción-gui ~2 ml peve peteĩ filtro centrífuga Amicon 100.000 MWCO-pe, ha oñemyenyhẽ 1,5 CV IMAC-gui de antemano Buffer equilibrated Superdex 200 16/600 tamaño columna de exclusión tamaño, ha upéi ojeelui peteĩchagua tampón-pe 1,5 CV ári. Oñembyaty espectro absorción rehegua umi fracción tamaño-exclusión rehegua ha oñeconcentra umi espectro absorción rehegua oguerekóva relación A880/A280 2,1 ári ha A880/A805 relación 4,6 ha 100 A880 ári, ojeporúva pya e oñembosako i hagua rejilla TEM congelada téra oñeñongatu -80°C-pe oñeikoteve peve.
Ojeporu congelador de inmersión Leica EM GP oñembosako i hagua umi rejilla TEM temperatura baja rehegua. Pe complejo ojedilui tampón IMAC-pe A880 de 50 peve, ha upéi ojekarga 5μl peteĩ malla de cobre revestida de carbono QUANTIFOIL 1.2/1.3 ojedeskarga pyahúva resplandor rehe (Agar Scientific, Reino Unido). Oñeincuba pe rejilla 20°C ha 60% humedad relativa-pe 30 s aja, upéi ojejohéi 3 s aja, ha upéi oñembogue etano líquido-pe -176°C-pe.
Umi dato complejo RC-LH114-W ojeregistra eBIC (Centro Electrónico de Bioimagen) (Fuente de Luz de Diamante Británico) microscopio Titan Krios rupive, omba'apóva tensión acelerante 300kV, orekóva magnificación nominal 130.000× ha energía de- Eiporavo brecha 20 eV. Ojeporu peteĩ Gatan 968 GIF Quantum orekóva detector de pico K2 ojehai haguã taꞌãngamýi modo de conteo-pe oñembyaty hag̃ua dato. Pe píxel calibrado tuichakue ha'e 1,048Å, ha pe dosis tasa ha'e 3,83 e-Å-2s-1. Ombyaty pe pelíkula 11 segúndope ha ombojaʼo 40 pártepe. Eipuru pe área oguerekóva carbono reenfoka jey hagua pe microscopio, ha upéi embyaty mbohapy película petet yvykua rehe. En total, oñembyaty 3130 película, orekóva valor desfoco -1 ha -3μm mbytépe.
Umi dato complejo RC-LH116 rehegua oñembyaty ojeporúvo microscopio peteĩchagua Laboratorio de Bioestructura Asterbury-pe (Universidad de Leeds, Reino Unido). Umi dato oñembyaty modo de conteo orekóva magnificación 130 k, ha pixel tuichakue ojecalibra 1,065 Å orekóva dosis 4,6 e-Å-2s-1. Pe pelíkula ojegrava 12 segúndope ha oñembojaʼo 48 pártepe. Opaite, oñembyaty 3359 película, oguerekóva valor desfoco -1 ha -3μm mbytépe.
Opaite procesamiento de datos ojejapo pipeline Relion 3.0-pe (42). Jaipuru Motioncorr 2 (43) ñamohenda hagua viga ñemongu e ponderación dosis rupive, ha upéi jaipuru CTFFIND 4.1 (44) jaikuaa hagua parámetro CTF (función de transferencia de contraste). Umi fotomicrografía típica ojejapo rire ko ã etapa procesamiento ñepyrũrã ojehechauka ta anga 2. S16-pe. Pe plantilla selección automática ojejapo ojeporavóvo manualmente 250 píxel rupi 1000 partícula peteĩ marco 250 píxel-pe ha ndaipóri referencia clasificación bidimensional (2D), upéicha oñembotove umi clasificación ombohováiva contaminación muestra rehegua térã ndorekóiva característica ojehechakuaáva. Upéi ojejapo selección automática opaite microfotografía rehe, ha RC-LH114-W oguereko 849.359 partícula, ha complejo RC-LH116 oguereko 476.547 partícula. Opaite partícula ojeporavóva ohasa mokõi ronda clasificación 2D ndaha éiva referencia, ha káda carrera rire, oñemboyke umi partícula ombohováiva área carbono, contaminación muestra, ndaipóri característica ojehechakuaáva térã partícula oñesuperponéva mbarete, upévagui 772.033 (90,9%) ha 359.678 (75,5%) ) Ojeporu partícula clasificación 3D-pe guarã RC-LH114-W ha RC-LH116 peteĩteĩ. Pe modelo de referencia 3D ñepyrũrã ojejapo ojeporúvo método descenso gradiente estocástico rehegua. Oipurúvo modelo ñepyrũrã referencia ramo, umi partícula ojeporavóva oñembojaꞌo irundy categoría-pe 3D-pe. Oipurúvo modelo ko categoría-pegua referencia ramo, ojejapo refinación 3D umi partícula categoría tuichavévape, upéi ojepuru filtro de paso bajo 15Å ñepyrũrã ojejaho i hagua área disolvente rehegua, oñembojoapy 6 píxel borde suave rehegua, ha ojejapo post-procesamiento umi píxel oñemyatyrõ hagua función transferencia Modulation pico Gatan K2 detector yvateguápe. Pe conjunto de datos RC-LH114-W-pe g̃uarã, ko modelo ñepyrũrã oñemoambue ojeipeꞌa rupi pe densidad mbarete oĩva umi máscara rembeꞌekuérape (oñemboykéva densidad compleja núcleo-gui Quimera UCSF-pe). Umi modelo osëva (umi resolución RC-LH114-W ha RC-LH116 ha'e 3,91 ha 4,16 Å, respectivamente) ojeporu referencia ramo mokõiha ronda clasificación 3D-pe guarã. Umi partícula ojeporúva oñemboaty clase 3D ñepyrũrãme ha ndorekói correlación mbarete barrio ndive. Oñembojoaju térã ndaipóri umi rasgo estructural ojehechakuaáva. Ojejapo rire mokõiha ronda clasificación 3D rehegua, ojeporavo pe categoría oguerekóva resolución ijyvatevéva [RC-LH114-W-pe g̃uarã, peteĩ categoría haꞌehína 377.703 partícula (44,5%), RC-LH116-pe g̃uarã, oĩ mokõi categoría, oguerekóva en total 260.752 partícula (54,7%) , Oĩháme peteĩchagua oñealinea jave añoite pe rotación ñepyrũrã rire peteĩ diferencia michĩva reheve]. Umi partícula ojeporavóva ojeipe a jey peteĩ caja 400 píxel-pe ha oñemboheko refinación 3D rupive. Pe máscara disolvente rehegua ojejapo ojeporúvo filtro de paso bajo ñepyrũrã 15Å, expansión mapa 3 píxel ha máscara suave 3 píxel. Oipurúvo refinamiento CTF por partícula, corrección movimiento por partícula ha mokõiha ronda refinamiento CTF por partícula, ojejapo refinamiento 3D, enmascarado disolvente ha post-procesamiento cada paso rire oñerrefinave haguã textura osëva. Oipurúvo valor de corte FSC (Coeficiente de Correlación de Shell de Fourier) 0,143, umi resolución modelo paha RC-LH114-W ha RC-LH116 ha'e 2,65 ha 2,80Å, respectivamente. Pe curva FSC modelo paha rehegua ojehechauka ta anga 2. S17-pe.
Opaite secuencia proteica ojegueru UniProtKB-gui: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4) rehegua; RC-L (PufL; ID UniProt rehegua: O83005); RC-M (PufM; ID UniProt rehegua: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID UniProt rehegua: A0A4Z9); Proteína-W (PufW; ID UniProt: Q6N1K3) rehegua. Ojeporu SWISS-MODEL (45) ojejapo hagua petet modelo homología RC rehegua, oguerekóva umi secuencia proteica RC-L, RC-M ha RC-H rehegua ha estructura cristalina Rba rehegua. sphaeroides RC ojeporu plantilla ramo (PDB ID: 5LSE) (46). Eipuru tembipuru “mapa de ajuste” Quimera UCSF-pe embojoaju hagua modelo generado mapa-pe (47), emoporãve estructura proteica, ha cofactor [4×BChl a (residuo biblioteca monómero réra = BCL), 2×BPh a (BPH), peteĩ térã mokõiichagua UQ10 (U10), peteĩ hierro no heme (Fe) ha peteĩ 3,4-dihidrohexacarbonilcolina (QAK)] oipuru Coot (48) omoĩ hagua. QAK ndojeguerekóigui biblioteca monómero-pe, oñeparametriza ojeporúvo tembiporu eLBOW PHENIX-pe (49).
Upe rire, ojejapo pe subunidad LH1. Ñepyrũrã ojeporu tembipuru automática construcción rehegua oĩva PHENIX-pe (49) ojejapo hag̃ua ijeheguiete peteĩ parte secuencia LH1 rehegua ojeporúvo mapa ha umi secuencia proteica LH1-α ha LH1-β entrada ramo. Eiporavo pe subunidad LH1 hekopetevéva, eipe a ha ekargá Coot-pe, emoí nde po rupive pe secuencia ofaltáva ipype, ha emopotî manóme pe estructura tuichakue emoí mboyve mokôi BCl a (BCL) ha petet espiriloxantina (CRT) [según umi Rps relevante Pe densidad complejo LH1 rehegua ha pe contenido carotenoide ojekuaáva. Especie (17) rehegua]. Ekopia subunidad LH1 completa, ha eipuru Quimera UCSF “Tembiporu Mapa de Acoplamiento” embojoaju hag̃ua pe área ndahaꞌeiva modelo ojoykéregua densidad LH1 rehegua, ha upéi errefina Coot-pe; ojejapo jey pe proceso oñemodelapa peve opaite subunidad LH1 rehegua. Pe estructura RC-LH114-W-pe g̃uarã, ojeipeꞌa rupi pe densidad noñeasignaivaꞌekue Coot-pe, ojesegmenta pe proteína umi componente ndahaꞌeiva proteína hembývagui mapa USCF Chimera-pe ha ojeporu tembipuru Autobuild oñemopyenda hag̃ua modelo ñepyrũrã, ha umi subunidad hembýva (proteína-W) Modelado. FENIX-pe (49). Oñemoĩ oimeraẽ secuencia ofaltáva pe modelo osëvape Coot (48)-pe, ha upéi oñerrefina manualmente pe subunidad tuichakue. Pe densidad hembýva noñeasignáiva oike pe combinación lípido (ID biblioteca monómero PDB de CDL = CDL, POPC = 6PL ha POPG = PGT), detergente β-DDM (LMT) ha moléculas UQ10 (U10). Eipuru optimización PHENIX (49) ha optimización manual Coot (48)-pe eperfecciona hagua modelo inicial completo ndaikatúi peve oñemyatyrõve estadística modelo rehegua ha calidad visual ajuste rehegua. Ipahápe, eipuru LocScale (50) embotuichave hag̃ua mapa local, ha upéi ejapo heta ambue ciclo emodelávo densidad noñeasignaivaꞌekue ha optimización automática ha manual.
Umi péptido, cofactor ha ambue lípido ha quinona oñembojoajúva densidad ryepýpe ojehechauka ta anga 1 ha 2. S18 guive S23 peve. Marandu estadística modelo paha rehegua ojehechauka cuadro S1-pe.
Ndoje’éiramo ambue mba’e, oñembyaty umi espectro absorción UV/Vis/NIR espectrofotómetro Cary60 (Agilent, EE.UU.)-pe, intervalo 1 nm-pe 250 nm guive 1000 nm peve ha peteĩ tiempo de integración 0,1s.
Ojedilui pe muestra petet cubeta de cuarzope oguerekóva tape 2 mm A880 de 1 peve, ha oñembyaty espectro absorción rehegua 400 ha 1000 nm mbytépe. Umi espectro dicroico circular oñembyaty espectropolarímetro Jasco 810 (Jasco, Japón)-pe, intervalo 1 nm-pe 400 nm ha 950 nm mbytépe, peteĩ velocidad de escaneo 20 nm min-1-pe.
Pe coeficiente de extinción molar ojehechakuaa ojediluívo complejo núcleo rehegua petet A880 peve haimete 50. Ojedilui pe volumen 10μl tampón de unión téra metanol 990μl-pe, ha oñembyaty pya e espectro absorción rehegua ikatu haguaicha oñeminimisa degradación BChl. Pe contenido BChl petettet muestra metanol rehegua ojekalkula coeficiente de extinción rupive 771 nm-pe 54,8 mM-1 cm-1, ha ojedetermina coeficiente de extinción ( 51 ). Ojedividi pe concentración BChl oñemediva ekue 32 (RC-LH114-W) téra 36 (RC-LH116) rehe ojekuaa hagua pe concentración complejo núcleo rehegua, upéi ojepuru ojekuaa hagua espectro de absorción petet muestra rehegua oñembyatýva coeficiente de Extinción tampón-pe. ijyvijojáva. Ojejapo mbohapy medición ojejapóva jey jey petettet muestra rehe, ha ojeporu absorbancia promedio máximo BChl Qy rehegua cálculo-pe. Pe coeficiente de extinción RC-LH114-W rehegua oñemediva 878 nm-pe ha e 3280±140 mM-1 cm-1, ha pe coeficiente de extinción RC-LH116 rehegua oñemediva 880 nm-pe ha e 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 oñecuantifika pe método oîva (52)-pe rupive. Mbykyhápe, ojejapo HPLC fase inversa (RP-HPLC) ojeporúvo sistema HPLC Agilent 1200. Ojejoso 0,02 nmol rupi RC-LH116 térã RC-LH114-W 50μl metanol:cloroformo 50:50-pe oguerekóva cloruro férrico 0,02% (p/v), ha oñeinyecta pe Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm ojeequilibrámava’ekue 1 ml-1 min-1-pe 40°C-pe HPLC-pe disolvente (80:20 metanol:2-propanol) petet columna ×25 cm rehe. Ojejapo elución isocrática disolvente HPLC-pe ojesareko hagua absorbancia rehe 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoides) ha 780 nm (BChl)-pe 1 aravo aja. Oñeintegra pe pico cromatograma 275 nm-pe 25,5 minuto-pe, ndorekóiva ambue compuesto ojehechakuaáva. Pe área integrada ojepuru ojekalkula hagua pe cantidad molar UQ10 ojeipe a va ekue ojehechávo pe curva de calibración oñecalculava ekue inyección guive umi estándar puro 0 guive 5,8 nmol peve (Figura S14). Káda muestra oñeanalisa mbohapy replicado-pe, ha pe error oñemombe'úva okorresponde SD promedio-pe.
Oñembosako i petet solución oguerekóva complejo RC-LH1 oguerekóva absorción máxima Qy 0,1, citocromo c2 kavaju korasõ reducido 30 μM (Merck, Reino Unido) ha 0 a 50 μMUQ2 (Merck, Reino Unido) reheve. Oñembosako i mbohapy muestra 1 ml peteîteî concentración UQ2-pe ha oñeincuba peteî pyhare pytũmbýpe 4°C-pe ojeasegura haguã adaptación completa pytũmbýpe oñemedi mboyve. Pe solución ojekarga espectrofotómetro modular OLIS RSM1000-pe oguerekóva rejilla llama/500 línea 300 nm, hendidura 1,24 mm entrada, 0,12 mm mbytépe ha 0,6 mm salida. Oñemoĩ peteĩ filtro de paso ipukúva 600 nm fototubo muestra ha tubo fotomultiplicador de referencia ojeikehápe oñemboyke haguã tesape excitación rehegua. Ojesareko absorbancia rehe 550 nm-pe peteĩ tiempo de integración 0,15 s reheve. Pe tesape excitación rehegua osẽ LED 880 nm M880F2 (Diodo Emisor de Luz) (Thorlabs Ltd., Reino Unido)-gui peteĩ cable de fibra óptica rupive 90% intensidad-pe peteĩ controlador DC2200 rupive (Thorlabs Ltd., Reino Unido) ha osẽ fuente de luz-pe peteĩ ángulo 90° de. Pe viga de medición oñemoĩ pe espejo rehe ojegueru jey hag̃ua oimeraẽ tesape iñepyrũrã ndojeguerahaivaʼekue pe muestra rupive. Ojesareko absorbancia rehe 10 s ojehesape mboyve 50 s. Upéi ojesarekove pe absorbancia rehe 60 s pytũmbýpe ojehecha hagua mba eichaitépa quinolol omboguejy ijeheguiete citocromo c23 + (ehecha ta anga S8 umi dato bruto rehegua).
Umi dato oñemboguata oñembojoajúvo peteĩ tasa inicial lineal 0,5 ha 10 s ryepýpe (odepende concentración UQ2 rehe) ha oñepromedio umi tasa mbohapyve muestra rehegua peteĩteĩ concentración UQ2-pe. Ojeporu concentración RC-LH1 okalkuláva coeficiente de extinción respectivo oñekonverti haguã tasa eficiencia catalítica-pe, ojetraza Origin Pro 2019 (OriginLab, EE.UU.)-pe, ha oñembojoaju modelo Michaelis-Menten-pe ojekuaa haguã valores aparentes Km ha Kcat.
Umi medición absorción transitoria rehegua, ojedilui muestra RC-LH1 ~2μM peve tampón IMAC-pe oguerekóva 50 mM ascorbato sódico (Merck, EE.UU.) ha 0,4 mM Terbutina (Merck, EE.UU.). Ácido ascórbico ojepuru donante de electrones sacrificio ramo, ha tert-butaclofeno ojepuru inhibidor QB ramo ojehecha hagua pe donante RC principal opyta hagua oñemboguejy (he ise, ndaha éi fotooxidado) pe proceso de medición pukukue javeve. Haimete 3 ml muestra oñembojehe a petet célula giratoria personalizada rehe (haimete 0,1 m diámetro, 350 RPM) oguerekóva 2 mm tape óptico ipukukue ikatu haguaicha pe muestra oíva láser rapepe oguerekoha tiempo suficiente adaptación iñypytûva pulso excitación apytépe. Eipuru pulso láser ~100-fs emombarete hagua sistema láser Ti: Sapphire (Spectra Physics, EE.UU.) emokyre y hagua muestra 880 nm-pe petet tasa de repetición 1 kHz-pe (20 nJ NIR-pe guará téra 100 nJ Vis-pe guará). Oñembyaty mboyve dato, oñembohasa muestra tesape excitación rehegua 30 minuto rupi. Pe exposición omoheñóita inactivación QA (ikatúva omboguejy QA peteĩ térã mokõi jey). Ha katu eñatendéke ko proceso ha’eha reversible peteĩ periodo pukukue rire adaptación iñypytũva, RC mbeguekatúpe ojevýta actividad QA-pe. Ojeporu espectrómetro Helios (Ultrafast Systems, EE.UU.) oñemedi haguã espectro transitorio orekóva tiempo de retraso -10 ha 7000 ps . Eipuru software Surface Xplorer (Ultrafast Systems, EE.UU.) embojaꞌo hag̃ua umi dato ryru, upéi embojoaju ha emohenda porã. Eipuru paquete software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) eipuru hag̃ua pe conjunto de datos oñembojoajúva ehupyty hag̃ua espectro diferencial ojoajúva decadencia rehe, térã eipuru peteĩ función ombojoajúva heta exponente instrumento ñembohovái ndive oñemohenda hag̃ua evolución espectral peteĩ longitud de onda rehegua Origin-pe (OriginLab, EE.UU.).
Ja e haguéicha yvateve (53), oñembosako i petet película fotosintética oguerekóva complejo LH1 ndoguerekóiva antena RC ha LH2 periférica. Pe membrana ojedilui 20 mM tris (pH 8,0)-pe ha upéi ojekarga petet cubeta de cuarzo-pe oguerekóva tape óptico 2 mm. Ojepuru petet pulso láser 30nJ ojeexcita hagua muestra 540 nm-pe petet tiempo de retraso -10 ha 7000 ps reheve. Emboguata pe dato ryru oñemombeꞌuháicha Rps-pe g̃uarã. pal muestra.
Pe membrana ojejapo pellet centrifugación rupive 150.000 RCF-pe 2 aravo aja 4°C-pe, ha upéi oñesuspende jey iabsorbancia 880 nm-pe 20 mM tris-HCl (pH 8,0) ha 200 mM NaCl-pe. Ojejoso pe membrana oñembopupu mbeguekatu rupi 2% (p/v) β-DDM-pe 1 aravo aja pytũmbýpe 4°C-pe. Pe muestra ojedilui carbonato de trietilamonio 100 mM (pH 8,0) (TEAB; Merck, Reino Unido)-pe, petet concentración proteica 2,5 mg ml-1 peve (análisis Bio-Rad). Ojejapove procesamiento pe método oñemoherakuãva ekue yma guive (54), oñepyrũvo ojedilui 50 μg proteína en total 50 μl TEAB oguerekóva 1% (p/v) laurato sódico (Merck, Reino Unido). Ojejapo rire sonicación 60 s, oñemboguejy 5 mM tris (2-carboxetil) fosfina (Merck, Reino Unido) 37 ° C 30 minutos. S-alquilación-pe guarã, oñeincuba pe muestra metil S-metiltiometanosulfonato 10 mM (Merck, Reino Unido) reheve ha oñembojehe a petet solución stock isopropanol 200 mM-gui 10 minuto aja temperatura ambiente-pe. Ojejapo digestión proteolítica oñembojehe ávo 2 μg tripsina/endoproteinasa Lys-C mezcla (Promega UK) ha oñeincuba 37°C-pe 3 aravo pukukue. Ojepe a pe tensioactivo laurato rehegua oñembojehe ávo 50 μl acetato de etilo ha 10 μl ácido trifluoroacético grado LC 10% (v/v) (TFA; Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) ha ojejapo vortex 60 s aja. Pe separación fase rehegua oñemotenonde centrifugación rupive 15.700 RCF-pe 5 minuto aja. Según protocolo fabricante, ojeporu columna de espín C18 (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) ojeaspira ha ojedessalta porã haguã fase inferior orekóva péptido. Ojeseca rire centrifugación de vacío rupive, ojedisuelve muestra 0,5% TFA ha 3% acetonitrilo-pe, ha 500 ng oñeanalisa cromatografía RP nanoflujo rupive oñembojoajúva espectrometría de masas rehe ojeporúvo umi parámetro sistema rehegua oñedetalláva yma.
Eipuru MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ojekuaa ha oñecuantifika hagua proteína ojeheka hagua Rps. palustris proteoma rehegua mba’ekuaarã ryru (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Umi dato proteómica espectrometría de masas rehegua oñeñongatu Alianza ProteomeXchange-pe PRIDE socio repositorio rupive (http://proteomecentral.proteomexchange.org) identificador conjunto de datos PXD020402 guýpe.
Ojejapo hagua análisis RPLC rupive oñembojoajúva espectrometría de masas de ionización electrospray rehe, oñembosako i complejo RC-LH1 Rps de tipo silvestre-gui. Oipurúvo pe método oñemoherakuãva’ekue yma (16), pe concentración proteica ojejapóva células palustris-pe ha’e 2 mg ml-1 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl ha 0,03% (p/v) β- (análisis Bio-Rad) ) DDM-pe. Ojejapoháicha protocolo fabricante rehegua, ojepuru kit de purificación 2D (GE Healthcare, EE.UU.) ojeipe a hagua 10 μg proteína método de precipitación rupive, ha ojejoso pe precipitado ácido fórmico 20 μl 60% (v / v) (FA), 20% (v / v) Acetonitrilo ha 20% (v/v) ype. Oñeanaliza cinco microlitro RPLC rupive (Dionex RSLC) oñembojoajúva espectrometría de masas (Maxis UHR-TOF, Bruker) rupive. Ojepuru columna MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) ojesepara hagua 60°C ha 100μlmin -1-pe, oguerekóva gradiente 85% (v / v) disolvente A [0,1% (v / v) FA ha 0,02% (V/v) solución acuosa TFA] guive 85%(v/v) disolvente B peve [0,1%(v/v) FA ha 0,02%(v/v) 90%(v/v) acetonitrilo TFA-pe] Oipurúvo fuente de ionización electrospray estándar ha parámetro por defecto hetave 60 minuto aja, espectrómetro de masas ohupyty 100 ha 2750 m/z (relación masa a carga). Oipytyvõvo portal recurso bioinformática ExPASy tembipuru FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), omohaꞌãnga espectro de masa umi subunidad complejo-pe.
Umi célula oñemongakuaa 72 aravo aja 100 ml NF-bajo (10μMm-2 s-1), mediano (30μMm-2 s-1) térã yvate (300μMm-2 s-1) tesape guýpe. Medio M22 (medio M22 ojeheja reihápe sulfato de amonio ha oñemyengovia succinato sódico acetato sódico rehe) petet botella tornillo 100 ml-pe (23). Po ciclo 30 s-pe, oñembojehe a perla de vidrio 0,1 micras petet relación volumen 1:1-pe ojelisa hagua umi célula ha oñembopiro y hielo ári 5 minuto aja. Pe materia insoluble, célula noñembyaíriva ha umi cuenta de vidrio ojeipe a centrifugación rupive 16.000 RCF-pe 10 minuto aja microcentrífuga banco-pe. Ojesepara pe membrana rotor Ti 70,1-pe 100.000 RCF tris-HCl 20 mM-pe (pH 8,0) gradiente sacarosa 40/15% (p/p) reheve 10 aravo aja.
Oje’e haguéicha ore rembiapo ohasava’ekuépe, inmunodetección pe etiqueta His rehegua PufW-pe ( 16 ). Mbykyhápe, complejo núcleo purificado (11,8 nM) térã membrana orekóva concentración RC ojoajúva (ojedetermináva oxidación ojeipe'ávo espectro diferencia reducido ha ombojoajúva carga gel tintado rehe) tampón de carga SDS 2x (Merck, Reino Unido) ojediluíva mokõi jey. Umi proteína ojeipe’a peteĩ gel NuPage bis-tris 12% réplica rehe (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido). Oñemyatyrõ peteĩ gel Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Reino Unido) reheve ojekarga ha ojehechauka hag̃ua pe subunidad RC-L. Pe proteína oĩva mokõiha gel-pe oñembohasa membrana flúor de polivinilideno activado metanol rupive (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) inmunoensayo-rã. Ojejoko pe membrana PVDF 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v / v) Tween-20 ha 5% (p / v) kamby en polvo desnatada-pe, ha upéi oñeincuba anticuerpo primario anti-His ndive (en Diluir el tampón anticuerpo [50 mM tris-HCl (pH 7,6), NaCl 150 mM ha 0,05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Laboratorios de Bethyl, EE.UU.)-pe 4 aravo aja. Ojejohéi rire 3 jey 5 minuto tampón anticuerpo-pe, oñembojoaju membrana peroxidasa rábano (Sigma-Aldrich, Reino Unido) anticuerpo secundario anti-ratón ndive (diluido 1:10.000 tampón anticuerpo-pe) Oñeincuba ikatu haguã ojehechakuaa (5 minuto ojejohéi rire 3 tampón anticuerpo-pe) ojeporúvo sustrato quimiluminacencia WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italia) ha Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Reino Unido) rehegua.
Ojejapo rupi pe distribución intensidad rehegua petettet gel tintado téra carril inmunoensayo rehegua, oñeintegra pe área pico guýpe ha ojekalkula pe relación intensidad rehegua RC-L (gel tintado) ha Proteína-W (inmunoensayo), ImageJ-pe (57) Ojejapo ta anga. Ko ã relación oñekonverti relación molar-pe oñeimo ávo pe relación RC-L ha proteína-W muestra RC-LH114-W puro-pe ha e 1:1 ha oñenormalisávo conjunto de datos entero he iháicha.
Umi material suplementario ko artículo-pe g̃uarã, ehecha http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Kóva haꞌehína peteĩ artíkulo ojeike hag̃ua abierta oñemyasãiva Creative Commons Atribución Licencia ñe’ẽme’ẽ rupive. Pe artíkulo oheja ojeporu, oñemyasãi ha ojejapo jey ojejokoʼỹre oimeraẽ médiope, pórke ojecita porã pe obra ypykue.
Ñe’ẽñemi: Rojerure ndéve añoite reme’ẽ hag̃ua ne kundaha renda ikatu hag̃uáicha pe tapicha remomaranduva’ekue pe páhinape oikuaa reipotáha ohecha pe kuatiañe’ẽ ha ndaha’eiha spam. Ndorojagarrái mba’eveichagua dirección de correo electrónico.
Ko porandu ojepuru oñeha’ã hag̃ua nde ha’épa peteĩ tapicha ohóva ha ojejoko hag̃ua spam ñembohasa ijehegui.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Felipe J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Isabel C. Martín, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrés Hitchcock, C. Neil Hunter
Pe estructura de alta resolución complejo trampa de luz 1 centro de reacción-pe ome e jesareko pyahu dinámica quinona rehegua.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Felipe J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Isabel C. Martín, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrés Hitchcock, C. Neil Hunter
Pe estructura de alta resolución complejo trampa de luz 1 centro de reacción-pe ome e jesareko pyahu dinámica quinona rehegua.
©2021 Asociación Americana de Adelanto de la Ciencia rehegua. opaite derecho ojeguerekóva. AAAS ha’e peteĩ socio HINARI, AGORA, OARE, CORO, CLOCKSS, CrossRef ha CONTADOR. CienciaAvances ISSN 2375-2548 rehegua.