Ko’áĝa *Dirección ko’áĝagua: Colonia 50931, Alemania, Colonia Excelencia Cluster Investigación rehegua Respuesta Celular Estrés rehegua Mba’asykuéra Envejecimiento rehegua (CECAD).
Pe neurodegeneración mba'asy mitocondrial rehegua ojehecha irreversible ramo oîgui limitado pe plasticidad metabólica neuronas rehegua, ha katu pe efecto disfunción mitocondrial rehegua autonomía celular metabolismo neuronal rehegua ñande retepýpe ndojekuaaporãi. Ko’ápe, roikuaauka proteoma específico celular umi neuronas Purkinje orekóva deficiencia progresiva OXPHOS omoheñóiva dinámica de fusión mitocondrial oñembyaíva. Rojuhu pe disfunción mitocondrial omoñepyrũha peteĩ cambio pypuku proteómica ámbito-pe, ipahápe ogueraháva activación secuencial umi programa metabólico preciso omano mboyve célula. Oñeha’arõ’ỹre, rodetermina inducción ojehechakuaáva piruvato carboxilasa (PCx) ha ambue peroxidasa ojoajúva suplementación umi intermedio ciclo TCA rehe. Pe inhibición PCx rehegua ombohape estrés oxidativo ha neurodegeneración, ohechaukáva aterosclerosis orekoha efecto protector umi neuronas ndorekóiva OXPHOS. Pe fusión mitocondrial jegueru jey umi neuronas terminalmente degeneradas-pe ombojere completamente ko'ã característica metabólica, upéicha ojejoko célula ñemano. Ore mba’e ojuhúva ohechakuaa umi tape ndojekuaáiva’ekue yma ome’ẽva resistencia disfunción mitocondrial-pe ha ohechauka ikatuha oñembojere neurodegeneración jepe umi etapa paha mba’asýpe.
Pe rol central mitocondria orekóva omantene haguã metabolismo energía neuronal oñemomba'eguasu umi síntoma neurológico extenso ojoajúva mba'asy mitocondrial yvypóra rehe. Hetave ko'ã mba'asy ojehu umi mutaciones génicas oreguláva expresión génica mitocondrial (1, 2) térã destrucción génica ojoajúva dinámica mitocondrial rehe, ohypýiva indirectamente estabilidad ADN mitocondrial (ADNm) (3, 4). Tembiapo mymba modelo-pe ohechauka ombohováivo disfunción mitocondrial umi tejido ijerére, ikatu oñeactiva umi vía metabólica conservadora (5-7), upéicha ome'ë perspectiva importante patogénesis ko'ã mba'asy compleja. Tuicha ojoavy, ñane entendimiento umi cambio metabólico umi tipo específico celular omoheñóiva fracaso general producción adenosina trifosfato mitocondrial cerebral (ATP) ha'e fundamental (8), omomba'eguasúva tekotevêha ojekuaa umi blanco terapéutico ikatúva ojeporu ojehapejoko térã ojehapejoko haguã mba'asy. Ojejoko hagua neurodegeneración (9). Ndaipóriramo marandu ha e pe hecho ojehechaha heta hendápe umi célula nerviosa oguerekoha flexibilidad metabólica limitadaiterei oñembojojávo umi tipo celular umi tejido ijeréregua rehe ( 10 ). Ojehechávo ko'ã célula oreko peteî rol central ocoordina haguã suministro de metabolitos neuronas-pe omokyre'ÿvo transmisión sináptica ha ombohováivo condición lesión ha mba'asy, capacidad oadapta haguã metabolismo celular umi condición desafiante tejido cerebral haimete oñelimitáva células gliales-pe (11-14). Avei, heterogeneidad celular inherente tejido cerebral tuicha ohapejoko estudio umi cambio metabólico oikóva subgrupo neuronal específico-pe. Upéicha rupi, sa’i ojekuaa umi consecuencia celular ha metabólica exacta orekóva disfunción mitocondrial umi neuronas-pe.
Ojekuaa haguã consecuencia metabólica disfunción mitocondrial, roipe'a neuronas Purkinje (PNs) iñambuéva etapa neurodegeneración omoheñóiva oñehundígui fusión membrana exterior mitocondrial (Mfn2). Jepémo umi mutaciones Mfn2 yvypórape oñembojoaju peteĩ forma de neuropatía sensorial motora hereditaria ojekuaáva Charcot-Marie-Tooth tipo 2A ramo (15), pe destrucción condicional Mfn2 rehegua umi ratones-pe ha’e peteĩ método ojehechakuaa porãva inducción de oxidación Fosforilación (OXPHOS) disfunción rehegua. Umi opaichagua subtipo neuronal (16-19) ha pe fenotipo neurodegenerativo osëva omoirü síntoma neurológico progresivo, ha'eháicha trastorno movimiento ( 18 , 19 ) térã ataxia cerebelosa ( 16 ). Oipurúvo peteî combinación proteómica cuantitativa (LFQ) sin etiqueta, metabolómica, imagen ha método virológico, rohechauka neurodegeneración progresiva omoheñói mbarete piruvato carboxilasa (PCx) ha ambue factor oîva arteriosclerosis PNs in vivo La expresión de enzimas. Ojeverifika haguã relevancia ko jejuhu, roregula específicamente expresión PCx umi PN deficiente Mfn2-pe, ha rojuhu ko operación ombohape estrés oxidativo ha ombopya'e neurodegeneración, péicha ohechauka azoospermia ome'ëva omanóva célula Adapabilidad metabólica. Expresión severa MFN2 ikatu osalva completamente degeneración terminal PN orekóva deficiencia severa OXPHOS, consumo masivo ADN mitocondrial, ha aparentemente red mitocondrial oñembyaíva, omomba'eguasúva ko forma de neurodegeneración ikatuha voi ojerecupera etapa avanzada mba'asýpe omano mboyve célula.
Ikatu haguã ojehecha umi mitocondria umi PN knockout Mfn2-pe, roiporu peteĩ cepa de ratón ohejáva umi mitocondria Cre-gui odependéva oapunta proteína fluorescente hovy (YFP) (mtYFP) (20) Cre expresión ha rohecha morfología mitocondrial in vivo. Rojuhu oñehundíramo pe gen Mfn2 umi PN-pe, ojedividi mbeguekatúpe pe red mitocondrial (Figura S1A), ha ojejuhu pe ñemoambue iñepyrũvéva 3 arapokõindy orekópe. Ojoavy, degeneración sustancial capa celular PN, ojehechaháicha pérdida inmunotinción Calbindina, noñepyrüi 12 semanas de edad peve (Figura 1, A ha B). Pe tiempo desigualdad oîva umi cambio iñepyrûmby morfología mitocondrial ha ojehecháva oñepyrûva omanóva neuronal oremomýi roinvestiga haguã umi cambio metabólico omoñepyrûva disfunción mitocondrial omano mboyve célula. Rojapo peteĩ estrategia oñemopyendáva clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)-pe roipe'a haguã YFP (YFP +)-expresando PN (Figura 1C), ha umi ratones control-pe (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ko'águi rire oñembohérava CTRL (Figura S1B). Pe optimización estrategia de gating oñemopyendáva intensidad relativa señal YFP rehe opermiti ñandéve ñamopotî cuerpo YFP+ (YFPhigh) umi PN ndaha'éiva PN (YFPneg) (Figura S1B) térã putativo fragmento axónico/dendrítico fluorescente (YFPlow; Figura S1D, izquierda), omoañetéva microscopio confocal (Figura S1D, derecha). Ojekuaa haguã identidad población clasificada, rojapo proteómica LFQ ha upéi análisis componente principal, ha rojuhu oîha separación hesakãva célula YFPhigh ha YFPneg (Figura S1C). Umi célula YFPhigh ohechauka enriquecimiento neto umi marcador PNs ojekuaáva (ha'éva Calb1, Pcp2, Grid2 ha Itpr3) (21, 22), pero ndaipóri enriquecimiento proteína ojehechaukáva jepi neuronas térã ambue tipo de célula (Figura 1D) ). Oñembojojávo muestra célula YFPclasificada-pe oñembyatýva experimento independiente-pe ohechauka coeficiente de correlación> 0,9, ohechaukáva reproducibilidad iporãva replicado biológico apytépe (Figura S1E). En resumen, ko'ã dato ovalida ore plan aislamiento agudo ha específico PN factible. Pe sistema conductor L7-cre ojeporúva omoheñóigui recombinación mosaico peteĩha arapokõindy parto rire (23), roñepyrũ rojuka umi ratones CTRL-gui ha condicional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Ombyaty neuronas. Ojejapopa rire recombinación, oñembohéra Mfn2cKO 4 arapokõindy orekópe. Punto final ramo, roiporavo 8 semanas de edad capa PN oî jave gueteri intacta jepénte ojehecha fragmento mitocondrial (Figura 1B ha Figura S1A). En total, rocuantifika en total 3013 proteína, umíva apytégui 22% rupi oñemopyenda anotaciones MitoCarta 2.0 oñemopyendáva proteoma mitocondrial mitocondrias ramo (Ta'anga 1E) (Ta'anga 1E) (24). Pe análisis de expresión génica diferencial ojejapóva arapokõindy 8-pe ohechauka 10,5% añoite opaite proteína oguerekoha tuicha ñemoambue (Ta anga 1F ha ta anga S1F), umíva apytégui 195 proteína oî regulada abajo ha 120 proteína oî regulada yvate (Ta anga 1F). Iporã ojehechakuaa “análisis de rutas innovadoras” ko conjunto de datos ohechauka umi genes expresados ​​diferencialmente ha eha principalmente peteî conjunto restringido de vías metabólicas específicas (Figura 1G). Iporã jaikuaa, jepémo pe regulación abajo umi tape ojoajúva OXPHOS ha señalización calcio rehe omoañete inducción disfunción mitocondrial umi PN deficiente fusión-pe, ambue categoría oikehápe principalmente metabolismo aminoácidos tuicha ojupi, péva oî en línea metabolismo oikóva umi PN mitocondrial-pe. Recableado ha’e peteĩchagua. mba’e’apo’ỹ rehegua.
(A) Ta’anga confocal representativa umi sección cerebelosa umi ratones CTRL ha Mfn2cKO ohechaukáva pérdida progresiva PNs (calbindina, gris); núcleo oñecontratinción DAPI reheve. (B) Cuantificación (A) rehegua (análisis de varianza unidireccional, ***P<0,001; n = 4 a 6 círculo mbohapy ratones-gui). (C) Tembiaporã experimental rehegua. (D) Distribución mapa haku rehegua umi marcador específico Purkinje rehegua (yvate) ha ambue tipo de célula rehegua (mbyte). (E) Diagrama Venn ohechaukáva mboy proteína mitocondrial ojehechakuaáva PN clasificado-pe. (F) Gráfico volcánico umi proteína expresada diferencialmente umi neuronas Mfn2cKO-pe 8 arapokõindýpe (valor de corte de significación 1,3). (G) Pe análisis tape creatividad rehegua ohechauka umi po tape iñimportantevéva regulación yvate (pytã) ha regulación yvy gotyo (hovy) Mfn2cKO PN-pe oñemboja’óva 8 arapokõindy ramo. Ojehechauka nivel de expresión promedio peteîteî proteína ojejuhúva. Mapa haku rehegua escala de grises: valor P ajustado. ns, ndaha’éi iñimportánteva.
Umi dato proteómica rehegua ohechauka mbeguekatúpe oguejyha pe expresión proteica complejo I, III ha IV rehegua. Umi complejo I, III ha IV opavave oguereko subunidad esencial codificada ADNmt-pe, ha katu complejo II, codificado nuclear-nte, básicamente noñeafectái (Figura 2A ha Figura S2A). . Ojoajúva umi resultado proteómica rehe, inmunohistoquímica umi sección tejido cerebeloso rehegua ohechauka MTCO1 (subunidad 1 oxidasa citocromo C mitocondrial 1) subunidad nivel complejo IV PN-pe oguejy mbeguekatúpe (Figura 2B). Pe subunidad codificada ADNmt-pe Mtatp8 tuicha oñemboguejy (Figura S2A), ha katu pe nivel estado estacionario pe subunidad ATP sintasa codificada nuclear-pe opyta iñambue’ỹre, péva ojoaju pe ojekuaáva complejo F1 submontaje ATP sintasa estable ndive, expresión ADNmt oĩ jave estable. Pe formación ha’e peteĩchagua. Oñeinterrumpi (7). Evaluación nivel ADNmt umi PN Mfn2cKO clasificado-pe reacción en cadena polimerasa en tiempo real (qPCR) omoañete oguejy mbeguekatúpe número de copia ADNmt. Oñembojojávo grupo control rehe, 8 arapokõindy orekópe, 20% rupinte pe nivel ADNmt Ojeguereko (Figura 2C). Ojoajúva ko ã resultado ndive, tinción microscopía confocal Mfn2cKO PNs ojehechakuaa haguã ADN ohechauka consumo dependiente tiempo nucleótido mitocondrial (Figura 2D). Rojuhu oîha candidato añoite oîva degradación proteína mitocondrial ha respuesta estrés-pe oîva regulado yvate, umíva apytépe Lonp1, Afg3l2 ha Clpx, ha factores de montaje complejo OXPHOS. Ndojejuhúi cambio significativo umi nivel de proteínas oîva apoptosis-pe (Figura S2B). Upéicha avei, rojuhu umi canal mitocondria ha retículo endoplásmico oîva transporte de calcio-pe oguerekoha cambio michîmínte (Figura S2C). Avei, evaluación proteína ojoajúva autofagia rehe ndojuhúi cambio significativo, ojoajúva inducción ojehecháva autofagosoma ojehecháva in vivo inmunohistoquímica ha microscopía electrónica rupive (Figura S3). Ha katu pe disfunción progresiva OXPHOS rehegua umi PN-pe omoirû umi cambio mitocondrial ultraestructural ojehechakuaáva. Umi clúster mitocondrial ikatu ojehecha umi célula rete ha yvyramáta dendrítico PN Mfn2cKO orekóva 5 ha 8 arapokõindy, ha estructura membrana interior ohasa tuicha cambio (Figura S4, A ha B). Ojoajúva ko'ã cambio ultraestructural ha tuicha disminución ADNm, análisis rebanadas agudas cerebeloras cerebeloras orekóva éster metil tetrametilrodamina (TMRM) ohechauka potencial membrana mitocondrial umi PN Mfn2cKO-pe tuicha oguejy (Figura S4C).
(A) Análisis curso tiempo rehegua nivel de expresión complejo OXPHOS rehegua. Ñapensamínte umi proteína orekóva P<0,05 8 arapokõindýpe (ANOVA de dos vías). Línea punteada: Ndaipóri ajuste oñembojojávo CTRL rehe. (B) Izquierda: Techapyrã peteĩ sección cerebelosa rehegua ojerokyva anticuerpo anti-MTCO1 reheve (barra de escala, 20 μm). Pe área oguerekóva umi célula Purkinje rete ojejaho'i hovy. Derecha: Cuantificación niveles MTCO1 rehegua (análisis de varianza unidireccional; n = 7 a 20 célula oñeanalisáva mbohapy ratones-gui). (C) Análisis qPCR-pe ADNmt copia número rehegua PN oñemboja’óvape (análisis de varianza unidireccional; n = 3 a 7 ratones). (D) Izquierda: Techapyrá petet rebanada cerebelosa rehegua oguerekóva etiqueta anticuerpo antiADN reheve (barra de escala, 20 μm). Pe área oguerekóva umi célula Purkinje rete ojejaho'i hovy. Oike: Cuantificación lesiones ADNmt rehegua (análisis de varianza unidireccional; n = 5 a 9 célula mbohapy ratones-gui). (E) Peteĩ techapyrã peteĩ sección cerebelosa aguda ohechaukáva células mitoYFP + Purkinje (flecha) peteĩ grabación abrazadera parche célula entera rehegua. (F) Cuantificación curva IV rehegua. (G) Grabaciones representativas inyección de corriente despolarizante rehegua umi célula Purkinje CTRL ha Mfn2cKO-pe. Rastro yvategua: Peteĩha pulso omoñepyrũva AP. Rastro inferior: Frecuencia AP máxima rehegua. (H) Cuantificación umi insumo espontáneo postsináptico rehegua (sPSPs). Pe rastro de grabación representativa ha pe relación zoom rehegua ojehechauka (I)-pe. Análisis de varianza unidireccional oñeanalisa n = 5 a 20 célula mbohapy ratones-gui. Umi dato ojehechauka media±SEM ramo; *P<0,05 ha; **P <0,01 ha; ***P<0,001 rehegua. (J) Rastro representativo AP espontáneo rehegua ojeregistráva ojeporúvo modo abrazadera parche perforada. Rastro yvategua: Frecuencia AP máxima. Rastro inferior: zoom peteĩ AP rehegua. (K) Ñacuantifika frecuencia AP promedio ha máxima (J) he iháicha. Prueba Mann-Whitney rehegua; n = 5 célula oñeanalisa irundy ryguasúgui. Umi dato ojehechauka media±SEM ramo; ndaha’éi iñimportánteva.
Ojehechakuaa ojehechaháicha daño OXPHOS Mfn2cKO PN orekóva 8 arapokõindy, ohechaukáva función fisiológica neuronas tuicha anormal. Upévare, roanalisa umi característica eléctrica pasiva umi neuronas deficientes OXPHOS-pe 4 a 5 semana ha 7 a 8 semana-pe rojapóvo grabación abrazadera parche célula entera rehegua umi rebanada cerebelosa aguda-pe (Figura 2E). Oñeha’arõ’ỹre, pe potencial promedio membrana opytu’úva ha resistencia de entrada umi neuronas Mfn2cKO ojogua pe control-pe, jepémo oĩ diferencia sutil umi célula apytépe (Tabla 1). Upéicha avei, 4 a 5 semana de edad, ndojejuhúi cambio significativo relación corriente-tensión (curva IV)-pe (Figura 2F). Ha katu, ndaipóri neuronas Mfn2cKO orekóva 7 a 8 semanas oikovéva régimen IV (paso de hiperpolarización), ohechaukáva oîha sensibilidad hesakãva potencial hiperpolarización ko etapa tardía-pe. Ojoavy, umi neuronas Mfn2cKO-pe, umi corriente despolarizante omoheñóiva descarga potencial de acción repetitiva (AP) ojetolera porã, ohechaukáva umi patrón de descarga general orekóva ndaha éi tuicha iñambuéva umi neuronas control 8 semanas orekóvagui (Tabla 1 ha Figura 2G). Upéicha avei, frecuencia ha amplitud umi corriente postsináptica espontánea (sPSC) oñembojoja umi grupo control-pe, ha frecuencia de eventos ojupi 4 arapokõindy guive 5 arapokõindýpe 7 arapokõindy guive 8 arapokõindy peve peteî aumento ojoajúva (Figura 2, H ha I). Pe periodo de maduración sináptica umi PN-pe (25). Ojehupyty avei resultado ojoguáva umi parche PNs perforado rire. Ko configuración ojoko posible compensación umi defecto ATP celular rehegua, ikatuháicha oiko grabación abrazadera parche célula entera-pe. En particular, noñeafectái potencial membrana opytu'úva ha frecuencia de disparo espontáneo umi neuronas Mfn2cKO (Figura 2, J ha K). En resumen, ko'ã resultado ohechauka umi PN orekóva disfunción evidente OXPHOS ikatúva ombohovái porã umi patrones de descarga alta frecuencia, ohechaukáva oîha mecanismo de compensación opermitíva omantene respuestas electrofisiológicas haimete normal.
Umi dato ojehechauka media ± SEM ramo (análisis de varianza unidireccional, prueba de comparación múltiple Holm-Sidak; *P<0,05). Pe unidad número ojehechauka paréntesis rupive.
Roñemoĩ roinvestiga haguã oimeraẽ categoría oĩva conjunto de datos proteómica-pe (Figura 1G) oikehápe umi tape ikatúva ombohovái deficiencia severa OXPHOS, upéicha romyesakã mba'érepa PN afectado ikatu omantene electrofisiología haimete normal (Figura 2, E a K). . Análisis proteómico ohechauka umi enzima oîva catabolismo aminoácido cadena ramificada (BCAA)-pe oîha significativamente regulada yvate (Figura 3A ha Figura S5A), ha producto paha acetil-CoA (CoA) térã succinil CoA ikatu osuplementa umi tricarboxilato ciclo Ácido arteriosclerosis (TCA)-pe. Rojuhu pe contenido BCAA transaminasa 1 (BCAT1) ha BCAT2 mokõivéva ojupi. Ocataliza hikuái peteîha etapa catabolismo BCAA omoheñóivo glutamato α-cetoglutarato-gui ( 26 ). Opaite subunidad omoheñóiva complejo cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada (BCKD) oñeregula ascendente (pe complejo cataliza descarboxilación posterior ha irreversible esqueleto carbono BCAA osëva) (Figura 3A ha Figura S5A). Ha katu ndojejuhúi ñemoambue ojehechakuaáva BCAA-pe voi pe PN oñemboja’óvape, ikatúva ojehu ojeguerahavégui celular ko’ã aminoácido esencial térã ojeporu ambue fuente (glucosa térã ácido láctico) oñembojoaju haguã ciclo TCA (Figura S5B). Umi PN ndorekóiva OXPHOS ohechauka avei ojupíha descomposición glutamina ha actividad transaminación 8 arapokõindy orekóvape, ikatúva ojehechauka regulación ojupíva enzima mitocondrial glutaminasa (GLS) ha glutamina piruvato transaminasa 2 (GPT2) (Figura 3, A ha C). Iporã ojehechakuaa pe regulación ojupíva GLS rehegua oñelimitáva pe isoforma glutaminasa C (GLS-GAC) oñembojoajúvape (pe cambio Mfn2cKO/CTRL rehegua ha’e haimete 4,5 jey, P = 0,05), ha pe regulación ojupíva específica umi tejido cáncer rehegua Ikatu oipytyvõ bioenergía mitocondrial. (27) rehegua.
(A) Pe mapa haku rehegua ohechauka pe cambio de pliegue nivel proteico rehegua pe ruta oje e va ekuepe guara 8 arapokõindýpe. (B) Techapyrá petet rebanada cerebelosa rehegua oguerekóva etiqueta anticuerpo anti-PCx reheve (barra de escala, 20 μm). Pe flecha hovy ohechauka pe célula Purkinje rete. (C) Análisis de expresión proteica curso de tiempo ojehechakuaáva candidato importante ramo aterosclerosis-pe guarã (prueba t múltiple, *FDR <5%; n = 3-5 ratones). (D) Yvate gotyo: Diagrama esquemático ohechaukáva umi tape iñambuéva ojeike hagua pe carbono etiquetado oíva trazador [1-13C]piruvato-pe (he ise, PDH téra ruta transarterial rupive). Iguýpe: Pe gráfico violín rehegua ohechauka porcentaje carbono marcado único (M1) oñekonvertíva ácido aspartíco, ácido cítrico ha ácido málico-pe ojeroky rire umi rebanada cerebelosa aguda [1-13C]piruvato reheve (prueba t pareada; ** P <0,01). (E) Análisis integral tembiasakue tiempo rehegua tape ojehechaukáva rehegua. Ñapensamínte umi proteína orekóva P<0,05 8 arapokõindýpe . Línea discontinua: ndaipóri valor ajuste rehegua (análisis de varianza de dos vías; * P <0,05; *** P <0,001). Umi dato ojehechauka media±SEM ramo.
Ore análisis-pe, catabolismo BCAA-gui oiko peteĩva umi tape clave up-regulación rehegua. Ko mba e ohechauka mbarete pe volumen de ventilación oikéva ciclo TCA-pe ikatuha oñemoambue PN-pe ofaltáva OXPHOS-pe. Kóva ikatu orrepresenta peteî forma tuichavéva cableado metabólico neuronal, ikatúva oreko impacto directo fisiología neuronal ha sobrevida mantenimiento jave disfunción severa OXPHOS. Ojoajúva ko hipótesis ndive, rojuhu enzima antiaterosclerótica principal PCx oîha regulada yvate (Mfn2cKO/CTRL oñemoambue 1,5 jey rupi; Figura 3A), péva catalizador conversión piruvato oxaloacetato-pe (28), ojegueroviáva oîha tejido cerebral-pe La expresión en is restringida astrocitos (29, 30). Ojoajúva umi resultado proteómica rehe, microscopía confocal ohechauka expresión PCx ojupi específicamente ha significativamente umi PN deficiente OXPHOS-pe, ha katu reactividad PCx ojerestringe principalmente umi célula glial Bergmann ojoykére control-pe (Figura 3B). Ojeproba haguã funcionalmente pe upregulación ojehecháva PCx rehegua, roñatende umi rebanada cerebelosa aguda rehe [1-13C] trazador de piruvato reheve. Ojeoxida jave piruvato piruvato deshidrogenasa (PDH) rupive, okañy etiqueta isótopo rehegua , Pero oñemoinge umi intermedio ciclo TCA-pe oñemetaboliza jave piruvato reacciones vasculares rupive (Figura 3D). Oipytyvõvo ore dato proteómica rehegua, rohechakuaa hetaiterei marcador ko trazador-gui ácido aspartico-pe umi rebanada Mfn2cKO-pe, ha katu ácido cítrico ha ácido málico oguereko avei tendencia moderada, jepémo ndaha éi significativa (Figura 3D).
Umi neuronas dopamina umi ratones MitoPark orekóva disfunción mitocondrial omoheñóiva neuronas dopamina específicamente ombyaíva específicamente gen factor de transcripción mitocondrial A (Tfam) (Figura S6B), expresión PCx avei significativamente regulada yvate (31), ohechaukáva arteriosclerosis ácido acetona Ocurrencia mba'asy ojeregula disfunción neuronal jave OXPHOS ñande retepýpe. Iporã ojehechakuaa ojejuhúha umi enzima ijojaha'ỹva (32-34) ikatúva ojehechauka neuronas ikatúva ojoaju arteriosclerosis rehe tuicha ojupi umi PN ndorekóiva OXPHOS-pe, ha'eháicha propionil-CoA carboxilasa (PCC-A), Malonil-CoA omoambue propionil-CoA succinil-CoA ha enzima málica mitocondrial 3 (ME3), . hembiapo tenondegua ha e orrekupera hagua piruvato malato-gui (Ta anga 3, A ha C) (33, 35). Avei, rojuhu tuicha ojupiha pe enzima Pdk3, ofosforiláva ha upéicha oinactiva PDH ( 36 ), ha katu ndojejuhúi ñemoambue pe enzima Pdp1 omombaretéva PDH térã pe complejo enzima PDH-pe voi (Figura 3A). Tapete, umi PN Mern2cKO-pe, oñembotuichave fosforilación subunidad α1 subunidad α (PDHE1α) componente piruvato deshidrogenasa E1 complejo PDH Ser293-pe (ojekuaáva ombotoveha actividad enzima PDH-pe) ( Figura S6C) (Figura S6C). Piruvato ndorekói acceso vascular.
Ipahápe, rojuhu pe súper vía biosíntesis serina ha glicina rehegua, ciclo folato mitocondrial (1C) ojoajúva ha biosíntesis prolina rehegua (Figura 1G ha Figura S5C) opavave oîha significativamente regulado yvate, según marandu, proceso de activación aja. Umi tejidos ijeréregua oñeactiva disfunción mitocondrial reheve (5-7). Análisis confocal oipytyvõva ko'ã dato proteómica ohechauka PN-pe ofaltáva OXPHOS, umi rebanada cerebelosa umi ratones 8 arapokõindy orekóva oñemoîva serina hidroximetiltransferasa 2 (SHMT2), enzima clave ciclo folato mitocondrial. Ñembohovái inmune tuicha mba’éva (Ta’anga S5D). 13 rebanadas agudas cerebelosa incubadas CU-glucosa-pe, umi experimento rastreo metabólico omoañeteve regulación ojupíva biosíntesis serina ha prolina rehegua, ohechaukáva ojupíha flujo isoformas de carbono serina ha prolina-pe (Figura S5E). Umi reacción omokyre'ÿva GLS ha GPT2 ha'égui responsable síntesis glutamato glutamina-gui ha transaminación glutamato ha α-cetoglutarato apytépe, upregulación orekóva ohechauka umi neuronas deficientes OXPHOS oreko demanda ojupíva glutamato , Kóva ikatu oñeha'ã omantene biosíntesis ojupíva prolina (Figura S5C). Ojoavy ko'ã cambio, análisis proteómico astrocitos cerebelosa umi ratones Mfn2cKO específico PN ohechauka ko'ã tape (oimehápe opavave antiperoxidasa) noñemoambuéi tuicha expresión-pe, upéicha ohechauka Ko redirección metabólica ha'e selectiva PN degradado-pe (Fig. S6, D a G).
En resumen, ko'ã análisis ohechauka significativamente iñambuéva patrones activación temporal umi vía metabólica específica umi PN-pe. Jepémo pe función mitocondrial neuronal anormal ikatu ogueru aterosclerosis ñepyrũrã ha remodelación 1C (Figura 3E ha Figura S5C), ha jepe umi cambio predecible expresión complejo I ha IV-pe, umi cambio síntesis serina de novo-pe ha e añoite Ojehechakuaa umi etapa tardía-pe añoite. OXPHOS rembiapo vai (Ta anga 3E ha Ta anga S5C). Ko'ã mba'e ojejuhúva odefini proceso secuencial oimehápe mitocondrial (ciclo 1C) ha citoplasmático (biosíntesis serina) inducida estrés ombohováiva sinérgicamente ojupívo aterosclerosis ciclo TCA-pe omohenda jey haguã metabolismo neuronal.
Umi PN orekóva 8 arapokõindy odeficiente OXPHOS-pe ikatu omantene actividad excitación alta frecuencia ha ohasa reconexión metabólica significativa ocompensa haguã disfunción mitocondrial. Ko descubrimiento omopu'ã peteî posibilidad interesante ko'ã momento-pe jepe, ko'ã célula ikatu avei Ohupyty intervención terapéutica ombotapykuévo térã ohapejokóvo neurodegeneración. Ka'aru. Rosoluciona ko posibilidad mokõi intervención independiente rupive. Peteĩha métodope, rodiseño peteĩ vector virus adeno asociado (AAV) odependéva Cre-gui ikatu hag̃uáicha ojehechauka selectivamente MFN2 umi PN deficiente OXPHOS-pe in vivo (Figura S7A). Ojeverifika AAV ocodigáva MFN2 ha gen reportero fluorescente mCherry (Mfn2-AAV) umi cultura neurona primaria in vitro, péva omoheñói MFN2 ojehechauka haguã de manera dependiente Cre-gui ha osalva morfología mitocondrial, upéicha ohapejoko neuromutación neuronas Mfn2cKO-pe ( Figura S7, B, D ha E). Upe rire, rojapo experimento in vivo romoguahẽ haguã estereotácticamente Mfn2-AAV orekóva 8 arapokõindy corteza cerebelosa Mfn2cKO ha umi ratones control, ha roanalisa umi ratones 12 semanas orekóva (Figura 4A). Umi ryguasu Mfn2cKO oñeñangareko va ekue rehe omano (Ta anga 1, A ha B) (16). Pe transducción viral in vivo rupive ojejapo expresión selectiva PN rehegua algunos círculos cerebelosos-pe (Figura S7, G ha H). Pe inyección AAV control rehegua oikuaaukáva mCherry añoite (Ctrl-AAV) ndorekói efecto significativo grado de neurodegeneración mymba Mfn2cKO-pe. Ojoavy, análisis Mfn2cKOs oñembohasáva Mfn2-AAV ndive ohechauka efecto protector significativo capa celular PN (Figura 4, B ha C). En particular, pe densidad neuronas ha eténte haimete ndojedistinguíriva umi mymba control-gui (Figura 4, B ha C, ha Figura S7, H ha I). Pe expresión MFN1 ha katu ndaha’éi MFN2 ha’e peteĩchaite efectivo osalva haguã ñemano neuronal (Figura 4C ha Figura S7, C ha F), ohechaukáva expresión MFN1 ectópico ikatuha osuplementa efectivamente falta de MFN2. Ojejapove análisis nivel PN único-pe ohechauka Mfn2-AAV tuicha osalva ultraestructura mitocondrias-pe, onormalisáva nivel ADNm, ha ombojere expresión yvate marcador antiangiogénesis PCx (Figura 4, C a E). Inspección visual umi ratones Mfn2cKO ojesalváva estado de descanso-pe ohechauka oñemyatyrõha postura ha síntoma motor (movimiento S1 a S3). Oñemohu'ãvo, ko'ã experimento ohechauka reintroducción retardada MFN2 umi PN deficiente tuicha OXPHOS-pe ha'e suficiente ombojere haguã consumo ADNm ha omoheñói aterosclerosis, upéicha ohapejoko degeneración axónica ha muerte neuronal in vivo.
(A) Peteí esquema ohechaukáva pe horario experimental oñeinyecta hagua AAV ocodigáva MFN2 oñeactiva jave pe vía metabólica ojehechaukáva. (B) Ta’anga confocal representativa umi sección cerebelosa orekóva 12 arapokõindy oñembohasáva umi ratones Mfn2cKO reheve 8 arapokõindýpe ha ojeroky anticuerpo anti-Calbindin reheve. Derecha: Escala umi fibra axónica rehegua. Pe escala zoom axónico rehegua ha e 450 ha 75 μm. (C) Izquierda: Cuantificación densidad celular Purkinje rehegua pe bucle de transducción AAV (AAV+)-pe (análisis de varianza unidireccional; n = 3 ratones). Oike: análisis de enfoque ADNmt PN transducido-pe arapokõindy 12-pe (prueba t no emparejada; n = 6 célula mbohapy ratones-gui). * P <0,05 ha; ** P <0,01 rehegua. (D) Micrografía electrónica transmisión representativa umi PN umi sección cerebelosa Mfn2cKO oñembohasáva umi vector viral ojehechaukáva reheve. Pe máscara rosa ohechauka pe área oguerekóva dendrita, ha pe cuadrado punteado hovy ohechauka pe zoom oñeme eva derecha gotyo; n ohechauka pe núcleo. Barra escala rehegua, 1μm. (E) ohechauka petet techapyrá tinción PCx rehegua PN-pe oñembohasáva 12 arapokõindýpe. Barra escala rehegua, 20μm. OE, ojehechauka hetaiterei; FC, pliegue ñemoambue.
Ipahápe, roinvestiga importancia orekóva sobrevivencia celular inducida peroxidasa rupive umi PN ohasáva disfunción OXPHOS. Rogenera mCherry ocodigáva AAV-shARN (ARN horquilla mbyky) ojepytasóva específicamente ARNm PCx ratón (AAV-shPCx), ha roinyecta virus térã control revuelto (AAV-scr) cerebelo ratón Mfn2cKO-pe. Pe inyección ojejapo irundyha arapokõindy edad-pe (Figura 5A) ojehupyty haguã knockdown PCx efectivo pe periodo ojupívo expresión PCx (Figura 3C) ha capa celular PN oî gueteri intacta (Figura 1A). Iporã ojehechakuaa ojeity ramo PCx (Ta anga S8A) ogueruha tuicha aceleración PN ñemano rehegua, ha e pe anillo restringido infección rehegua añoite (Ta anga 5, B ha C). Ojekuaa haguã mecanismo umi efecto metabólico omoheñóiva PCx up-regulación, roestudia estado redox PNs rire PCx knockdown ha biosensor óptico mediado AAV Grx1-roGFP2 oñeexpresa simultáneamente (Figura S8, B a D) oevalua haguã glutatión Pe cambio relativo potencial redox péptido (38). Upéi, rojapo microscopía de imagen vida útil de fluorescencia de dos fotones (FLIM) umi rebanada cerebral aguda Mfn2cKO orekóva 7 arapokõindy térã umi compañero de basura control rohechakuaa haguã umi cambio potencial estado redox citoplasmático roverifika rire condición FLIM (Figura S8, E a G). Pe análisis ohechauka tuicha ojupiha estado de oxidación peteî PN Mfn2cKO-pe ndorekóiva expresión PCx, iñambuéva neuronas control térã PN Mfn2cKO oikuaaukáva ARNsh revuelto añoite (Figura 5, D ha E). Ojeregula jave expresión PCx oguejy, porcentaje PN Mfn2cKO ohechaukáva estado oxidado yvate ojupi hetave mbohapy jey (Figura 5E), ohechaukáva regulación ojupíva PCx omantene capacidad redox neuronas degeneradas.
(A) Peteí esquema ohechaukáva pe horario experimental oñeinyecta hagua AAV ocodigáva shPCx oñeactiva jave pe vía metabólica ojehechaukáva. (B) Ta’anga confocal representativa umi sección cerebelosa orekóva 8 arapokõindy umi ratones Mfn2cKO-pe oñetransducíva ha ojeroky anticuerpo anticalcineurina reheve 4 arapokõindýpe. Barra escala rehegua, 450μm. (C) Cuantificación densidad celular Purkinje rehegua umi bucle transducido AAV-pe (análisis de varianza unidireccional; n = 3 a 4 ratones). Umi dato ojehechauka media±SEM ramo; ***P<0,001 rehegua. (D) Ta'anga FLIM representativa ohechauka vida promedio PN orekóva 7 arapokõindy oikuaaukáva sensor redox glutatión Grx1-roGFP2 umi condición experimental especificada. LUT (cuadro ojesarekóva) ratio: intervalo tiempo de sobrevida (picosegundos-pe). Barra escala rehegua, 25μm. (E) Histograma ohechauka distribución valores Grx1-roGFP2 tekove pukukue (D) guive (n=158 guive 368 células mokõi ratones-pe peteîteî condición-pe). Pe gráfico circular oîva peteîteî histograma ári: ohechauka mboy célulapa oguereko valor vida útil tuicha ipukuvéva (pytã, oxidado) térã mbykyvéva (hovy, reducido), ohasáva 1 SD valor promedio de vida CTRL-AAV-scr-pe. (F) Pe modelo oñeproponéva ohechauka pe efecto protector oguerekóva pe upregulación PCx neuronal rehegua.
Opa mba’e, umi dato rome’ẽva ko’ápe ohechauka pe reexpresión MFN2 ikatuha osalva completamente PN avanzado orekóva deficiencia OXPHOS severa, depleción severa ADNm, ha morfología ista-ichagua extremadamente anormal, upéicha ome’ẽ progreso continuo jepe umi mba’asy avanzada-pe. Neurodegeneración ome'ë evidencia reversible etapa omano mboyve célula. Ko grado de flexibilidad metabólica ojehechaukave umi neuronas ikatuha omoheñói aterosclerosis (peteî cableado ciclo TCA rehegua), ombotovéva expresión PCx umi PN ndorekóiva OXPHOS ha omombaretéva omanóva célula, upéicha oguereko peteî rol protector (Figura 5F).
Ko estudio-pe, rome’ẽ evidencia ombohováiva umi PN disfunción OXPHOS-pe ha’e oñeconverge mbeguekatúpe aterosclerosis ciclo TCA-pe pe vía de activación diferencial rupive oactiváva umi programa metabólico rupive. Romoañete análisis proteómico heta método complementario ha ojekuaa oñedesafia jave disfunción mitocondrial severa, neuronas oreko forma ndojekuaáiva yma elasticidad metabólica. Ore sorpresarã, pe proceso de cableado pukukue ndaha’éi katuete omarkáva pe estado metabólico terminal omoirûva neurodegeneración mbeguekatúpe ha irreversiblemente, ha katu ore dato ohechauka ikatuha omopyenda peteĩ neurona mantenimiento rehegua jepe pe etapa omano mboyve célula Mecanismo de compensación funcional. Ko mba'e ojejuhúva ohechauka umi neuronas orekoha peteî grado considerable plasticidad metabólica ñande retepýpe. Ko hecho ohechauka pe reintroducción MFN2 upe rire ikatuha ombojere expresión marcador metabólico clave ha ohapejoko degeneración PN. Upéva rangue, ojoko pe aterosclerosis ha ombopyaʼe umi nervio. transsexual.
Peteĩ mba’e ojejuhúva ñanembovy’avéva ore investigación-pe ha’e umi PN ndorekóiva OXPHOS ikatuha omoambue metabolismo ciclo TCA-pegua oregula rupi yvate umi enzima omokyre’ỹva específicamente arteriosclerosis. Pe reordenamiento metabólico ha’e peteĩ mba’e ojehechavéva umi célula cáncer rehegua, oĩ ojerovia glutamina rehe ombohetave haguã umi intermedio ciclo TCA-pe ojapo haguã equivalente reductor, omotenondéva cadena respiratoria ha omantene producción precursor biosíntesis lípido ha nucleótido rehegua (39 , 40). Peteî estudio nda’aréi ojejapóva ohechauka umi tejido periférico ohasáva disfunción OXPHOS, reconexión metabolismo glutamina/glutamato ha’e avei peteî característica destacada ( 5 , 41 ), ko’ápe dirección ojeike haguã glutamina ciclo TCA-pe odepende Oîgui gravedad lesión OXPHOS ( 41 ). ). Ha katu ndaipóri evidencia hesakãva mba’eveichagua joavy plasticidad metabólica neuronal rehegua ñande retepýpe ha ikatúva oreko relevancia mba’asy contexto-pe. Peteĩ estudio in vitro nda’aréi ojejapóvape, ojehechauka umi neuronas corticales primarias omokyre’ỹha umi piscina glutamato rehegua neurotransmisión-rã, upéicha omokyre’ỹ metabolismo oxidativo ha aterosclerosis condición de estrés metabólico-pe ( 42 ). Iporã ojehechakuaa inhibición farmacológica enzima ciclo TCA succinato deshidrogenasa guýpe, ojeguerovia carboxilación piruvato omantene síntesis oxaloacetato neuronas gránulo cerebelosa cultivado ( 34 ). Ha katu, pe relevancia fisiológica ko’ã mecanismo orekóva tejido cerebral-pe (ojegueroviahápe aterosclerosis oñeconfina principalmente astrocitos-pe) oreko gueteri significación fisiológica importante ( 43 ). Ko kásope, ore dato ohechauka umi PN oñembyaíva OXPHOS hetepýpe ikatu oñemoambue degradación BCAA ha carboxilación piruvato, ha'éva mokõi fuente principal suplementación intermedio piscina TCA. Jepémo oñepropone aporte putativo catabolismo BCAA metabolismo energía neuronal-pe, además de la rol glutamato ha GABA neurotransmisión-pe guarã ( 44 ), ndaipóri gueteri evidencia ko'ã mecanismo in vivo. Upévare, ndahasýi ojeespekula haguã umi PN disfuncional ikatuha ocompensa automáticamente consumo intermedio TCA impulsado proceso de asimilación ombohetávo aterosclerosis. En particular, ikatu oñeikotevë upregulación PCx omantene haguã demanda ojupíva ácido aspartico, ojehechaukáva células proliferantes orekóva disfunción mitocondrial ( 45 ). Ha katu, ore análisis metabolómica ndohechaukái mba'eveichagua cambio significativo nivel estado estacionario ácido aspartico umi PN Mfn2cKO-pe (Figura S6A), presumiblemente ohechauka diferente utilización metabólica ácido aspartico umi célula proliferante ha neuronas post-mitóticas apytépe . Jepémo pe mecanismo exacto upregulación PCx rehegua umi neuronas disfuncionales in vivo-pe opyta oñekarakterisa haguã, rohechauka ko respuesta prematuro oguerekoha peteĩ rol importante omantene haguã estado redox neuronas rehegua, ojehechaukáva umi experimento FLIM-pe umi rebanada cerebelosa rehe. En particular, ojejokóramo umi PN-pe oregula haguã PCx yvate ikatu ogueru estado oxidadovéva ha ombopyaꞌeve célula ñemano. Pe activación degradación BCAA ha pe carboxilación piruvato rehegua ndaha’éi tape ojekarakterisa haguã umi tejido periférico disfunción mitocondrial rehegua (7). Upévare, ha’ete ku ha’éva peteĩ mba’e omotenondéva umi neuronas deficiente OXPHOS-pe, ndaha’éiramo jepe pe mba’e añoite, iñimportánteva neurodegeneración-pe g̃uarã. .
Mba’asy cerebelosa ha’e peteĩ mba’asy neurodegenerativa heterogénea ojehechaukáva jepi ataxia ramo ha heta jey ombyai umi PN ( 46 ). Ko población neuronas ha'e particularmente vulnerable disfunción mitocondrial-pe péva degeneración selectiva orekóva umi ratones-pe ha'égui suficiente omoheñói jey haguã heta umi síntoma motor okarakterisáva ataxia espinocerebelosa yvypóra ( 16 , 47 , 48 ). Ojekuaaháicha, peteî modelo de ratón transgénico orekóva gen mutante ojoaju ataxia espinocerebelosa humana ha orekóva disfunción mitocondrial ( 49 , 50 ), omomba'eguasúva importancia oestudia consecuencia deficiencia OXPHOS PNPH-pe. Upévare, iporãiterei ojeipeʼa ha ojestudia porã hag̃ua ko población de neuronas ijojahaʼỹva. Ha katu, ojehechávo umi PN oñandu porãitereiha presión ha oguerekoha peteĩ proporción michĩva opaite población célula cerebelosa-gui, heta estudio oñemopyendáva ómico-pe, separación selectiva chuguikuéra célula entera ramo ha’e gueteri peteĩ aspecto desafiante. Jepémo haimete ndaikatúi ojehupyty falta absoluta contaminación ambue tipo celular (especialmente tejidos adultos), rombojoaju peteî paso de disociación efectivo FACS ndive rohupyty haguã suficiente número de neuronas viable análisis proteómica aguas abajo-pe guarã, ha roguereko cobertura proteica Bastante yvate (3000 proteína rupi) oñembojojávo conjunto de datos oîva cerebelo pukukue ( 51 ). Oñongatúvo viabilidad célula entera rehegua, pe método rome éva ko ápe ndaha éi jajesareko hagua umi cambio vía metabólica mitocondria-pe añónte, sino avei jahecha hagua umi cambio icomparéro citoplasmático-pe, omoañetéva enriquecimiento etiqueta membrana mitocondrial jeporu específico umi tipo celular rehegua Pe método pyahu ojehechávo mboy mitocondria oguereko umi tejido complejo-pe (52, 53). Pe método romombe’úva ndaha’éi ojoajúva estudio de células Purkinje rehe añónte, ha katu ikatu ojeporu fácilmente oimeraẽ tipo de célula-pe oñembohovái haguã umi cambio metabólico apytu’ũ hasývape, oikehápe ambue modelo disfunción mitocondrial rehegua.
Ipahápe, rohechakuaa peteĩ ventana terapéutica ko proceso de reordenamiento metabólico aja ikatúva ombojere completamente umi signo clave estrés celular rehegua ha ohapejoko degeneración neuronal. Upévare, oñentende implicancia funcional orekóva cableado oñemombe'úva ko'ápe ikatu ome'ë perspectiva fundamental umi tratamiento ikatúva omantene viabilidad neuronal disfunción mitocondrial jave. Oñeikotevë investigación futura orekóva hembipotápe odisecciona umi cambio metabolismo energético ambue tipo de célula cerebral-pe ojekuaa haguã plenamente aplicabilidad ko principio ambue mba'asy neurológica-pe.
Umi ryguasu MitoPark rehegua oñemombe’u kuri yma ( 31 ). Umi ratones C57BL/6N orekóva loxP flanqueante genes Mfn2 oñemombe'u kuri yma ( 18 ) ha oñembohasa umi ratones L7-Cre ndive ( 23 ). Upe rire oñembohasa umi progenie doble heterocigótica osêva umi ratones homocigóticos Mfn2loxP/Mfn2loxP ndive, oñemoheñói haguã knockouts génicos específicos Purkinje-pe guarã Mfn2-pe guarã (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Peteĩ subconjunto de apareamiento-pe, oñemoinge alelo SorStop-mito-YFP Gt (ROSA26) (stop-mtYFP) umi kurusu adicional rupive ( 20 ). Opaite mymbakuéra rembiapo ojejapo he’iháicha umi directriz europea, nacional ha institucional ha omonéî LandesamtfürNatur Umwelt ha Verbraucherschutz, Renania del Norte-Westfalia, Alemania-pegua. Mymbakuéra rembiapo avei osegi Federación Europea de Asociaciones de Ciencias Animales de Laboratorio ñesãmbyhy.
Oñeanestesia rire pe kuña hyeguasúva dislocación cervical, ojeipe a pe embrión ratón rehegua (E13). Ojejapo disección corteza Solución de Sal Equilibrado (HBSS) Hanks-pe oñembohetavéva Hepes 10 mM reheve ha oñembohasa Medio de Águila Modificada Dulbecco-pe oguerekóva papaína (20 U/ml) ha cisteína (1μg/ml). Oñeincuba pe tejido DMEM-pe) ha ojedisocia digestión enzimática rupive. Ml) 37°C-pe 20 minuto aja, ha upéi oñembojehe a mecánicamente DMEM-pe oñembohetavéva suero bovino fetal 10% reheve. Oñeñotỹ célula umi lámina de vidrio revestida polilisina reheve densidad 2×106 por plato de cultivo 6 cm térã densidad 0,5×105 células/cm2 análisis de imagen-pe guarã. 4 aravo rire, oñemyengovia pe medio medio ndorekóiva suero Neurobasal oguerekóva suplemento B27 1% ha GlutaMax 0,5 mM. Upéi oñemantene umi neuronas 37°C ha 5% CO2-pe pe experimento pukukue javeve, ha oñemongaru peteĩ jey peteĩ arapokõindýpe. Ojejapo hagua recombinación in vitro, ojeporu 3μl (plato de cultivo 24 pozos) téra 0,5μl (placa de 24 pozos) ko a vector virus AAV9 rehegua oñepohano hagua neuronas mokôiha ára in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, catálogo número 105530-AAV9) ha AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, catálogo número 105545-AAV9).
ADN complementario Mfn1 ha Mfn2 ratón rehegua (ojehupytýva plásmido Addgene #23212 ha #23213-gui, peteĩteĩ) oñemarka secuencia V5 (GKPIPNPLLGLDST) reheve C-terminal-pe, ha oñembojoaju mCherry ndive marco-pe secuencia T2A rupive. Grx1-roGFP2 ha'e peteĩ jopói Heidelberg T. P. Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum)-gui. Oñemyengoviávo cassette tdTomato ojeporúvo método clonación convencional, oñesubclona cassette columna vertebral pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (Número de referencia Addgene 28306)-pe, ojejapo haguã pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ha Umi vector pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 rehegua. Ojeporu estrategia ojoguáva ojejapo haguã vector control pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Ojejapo hagua constructo AAV-shPCx, oñeikoteve petet vector AAV plásmido (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), oguerekóva secuencia ADN ocodigáva shRNA ojepytasóva PCx ratón rehe (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) Pe promotor U6 poguýpe, ojeporu mCherry pe promotor CMV poguýpe. Pe producción vector AAV auxiliar rehegua ojejapo he iháicha fabricante (Cell Biolabs). Mbykyhápe, ojepuru peteĩ plásmido transferencia ogueraháva mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) sapy’ami Transfección de células 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) térã Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) gen codificador, avei ocodigáva proteína cápsida AAV1 ha proteína accesoria Plásmido plásmido envasado, ojeporúvo método fosfato de cálcio. Pe sobrenadante virus crudo ojehupyty ciclo congelación-descongelación rupive baño hielo seco/etanol-pe ha células lisas salina tamponada fosfato (PBS)-pe. Pe vector AAV oñembohykúi ultracentrifugación gradiente iodixanol discontinua rupive (24 aravo 32.000 rpm ha 4°C-pe) ha oñeconcentra ojeporúvo filtro centrífuga Amicon ultra-15. Título genoma AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 copia genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX ha’e oje’e haguéicha yma (54), oñemedi PCR cuantitativa tiempo real (qPCR) rupive. -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) ha AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml) rehegua.
Ojepe’a umi neuronas primarias PBS 1x ro’ysã hielo-icha, ojejapo pellet, ha upéi oñehomogeneisa 0,5% desoxicolato sódico/tampón de lisis PBS PBS-pe oguerekóva fosfatasa ha inhibidor proteasa (Roche). Ojejapo cuantificación proteica ojeporúvo ensayo ácido bicinconínico (Thermo Fisher Scientific). Upéi ojeipe a umi proteína electroforesis gel SDS-poliacrilamida rupive, ha upéi ojejohéi peteĩ membrana flúor de polivinilideno rehe (GE Healthcare). Ojejoko umi sitio no específico ha oñeincuba anticuerpo primario ndive (ehecha cuadro S1 detalle rehegua) kamby 5%-pe TBST-pe (salina tamponada Tris-pe Tween reheve), umi paso de lavado ha anticuerpo secundario TBST-pe Incubate. Oñeincuba anticuerpo primario ndive peteî pyhare pukukue +4°C-pe. Ojejohéi rire, ojeporu anticuerpo secundario 2 aravo aja temperatura ambiente-pe. Upe rire, oñeincuba rupi pe blot peteĩchagua peteĩ anticuerpo anti-β-actina reheve, oñemoañete peteĩchagua carga. Detección oñemoambuévo quimioluminescencia-pe ha omombaretévo quimioluminescencia (GE Healthcare).
Umi neurona oñeñotỹva’ekue yma umi lámina de tapa de vidrio rehe ojefija 4% paraformaldehído (PFA)/PBS reheve pe punto de tiempo oje’évape temperatura ambiente-pe 10 minuto aja. Umi lámina ojepermea raẽ Triton X-100/PBS 0,1% reheve 5 minuto aja temperatura ambiente-pe, ha upéi tampón bloqueante-pe [3% albúmina de suero bovino (BSA)/PBS]. Mokõiha árape, ojejohéi umi lámina de cubierta tampón bloqueante reheve ha oñeincuba anticuerpo secundario conjugado fluoróforo rehegua hekopete reheve 2 aravo aja temperatura ambiente-pe; ipahápe, ojejohéi porã umi muestra PBS-pe 4′,6-diamidino-2 -Fenilindol (DAPI) reheve oñecontratinta ha upéi ojefija diapositiva microscopio rehe Aqua-Poly/Mount rupive.
Umi ryguasu (kuimba’e ha kuña) oñeanestesia inyección intraperitoneal ketamina (130 mg/kg) ha xilazina (10 mg/kg) rupive ha oñeme’ẽ subcutáneamente carprofeno analgésico (5 mg/kg) reheve , Ha oñemoĩ peteĩ instrumento estereotáctico (Kopf) equipado peteĩ almohadilla hakuáva reheve. Ojehechauka akãrague ha ojeporu taladro dental oñembopiro y hagua pe parte corteza cerebelosa rehegua okorrespondéva hueso mis-pe (lambda guive: cola 1,8, lateral 1, okorrespondéva lóbulo IV ha V-pe). Eipuru petet aguja jeringa curva rehegua eñangareko hagua petet yvykua michtva akãrague rehe ani hagua rembyai pe vasculatura iguypegua. Upéi oñemoinge mbeguekatúpe pe capilar de vidrio ojedibujáva ipire hũva pe micro-agujero-pe (-1,3 guive -1 peve lado ventral dura mater-pe), ha oñeinyecta 200 ha 300 nl AAV micro-inyector-pe (Narishige) jeringa manual (Narishige) reheve heta jey presión michĩvape peteĩ periodo de tiempo 10 a 20 minuto ventána aja. Ojejapo rire pe infusión, ñamoĩ pe capilar ambue 10 minuto aja ikatu hag̃uáicha pe virus oñemyasãipaite. Ojepe’a rire umi capilar, ojesutura porã pe pire ikatu haguã sa’ive oñeinflama herida ha ikatu haguã mymba ojerekupera. Umi mymba oñepohano analgésicos (caspofeno) reheve heta ára operación rire, upe aja ojesareko porã condición física rehe ha upéi ojeeutanasia pe punto de tiempo oje’évape. Opaite procedimiento ojejapo he’iháicha umi directriz europea, nacional ha institucional ha omonéî LandesamtfürNatur Umwelt ha Verbraucherschutz, Renania del Norte-Westfalia, Alemania-pe.
Mymbakuérape oñeanestesia ketamina (100 mg/kg) ha xilazina (10 mg/kg) reheve, ha oñembohyru raẽ ikorasõ 0,1 M PBS reheve, ha upéi 4% PFA reheve PBS-pe. Ojedisecciona pe tejido ha ojefija 4% PFA/PBS-pe peteî pyhare pukukue 4°C-pe. Ojeporu peteĩ kyse oryrýiva (Leica Microsystems GmbH, Viena, Austria) oñembosako i hagua secciones sagitales (50 μm grueso) cerebro fijo-gui PBS-pe. Ndaipóriramo ambue mba e oje e va ekue, ojejapo tinción umi sección flotante libre rehegua oje e haguéicha yvateve (13) temperatura ambiente-pe ha oñembopupu. Mbykyhápe, tenonderãite, umi rebanada ojehupytýva oñepermeabiliza 0,5% Triton X-100/PBS reheve 15 minuto aja temperatura ambiente-pe; algunos epítopos-pe guarã (Pcx ha Shmt2), por en tampón tris-EDTA 80°C-pe (PH 9) oñembohyku umi rebanada 25 minuto aja ko paso rangue. Upe rire, oñeincuba umi sección anticuerpo primario reheve (ehecha cuadro S1) tampón bloqueante-pe (3% BSA/PBS) 4°C-pe peteĩ pyhare pukukue oñembopupu aja. Ambue árape, ojejohéi umi sección tampón bloqueante reheve ha oñeincuba anticuerpo secundario conjugado fluoróforo rehegua ohóva hese 2 aravo aja temperatura ambiente-pe; ipahápe, ojejohéi porã umi sección PBS-pe, oñecontratinta DAPI reheve, ha upéi ojefija AquaPolymount reheve On a microscopio diapositiva.
Ojeporu microscopio confocal de escaneo láser (TCS SP8-X térã TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) oguerekóva láser tesape morotĩ ha láser ultravioleta 405 diodo rehegua ojejapo haguã ta anga muestra rehegua. Oñemokyre yvo fluoróforo ha ombyatyvo señal Detector Híbrido (HyDs) rupive, ojepuru software LAS-X oñembyaty hagua ta anga apilado ojoajúva muestreo Nyquist rehe modo secuencial-pe: umi panel ndaha éiva cuantitativo-pe guará, ha e señales altamente dinámicas (techapyrã, células somáticas ha dendritas-pe) mtYFP) Ojepuru HyD ojehechakuaa hagua mboy PNpa oguereko modo BrightR-pe). Ojeporu gating 0,3 ha 6 ns oñemboguejy hagua fondo.
Imagen tiempo real umi célula oñembojaꞌovaꞌekue rehegua. Ojejapo rire clasificación medio Neurobasal-A oguerekóva 1% suplemento B27 ha 0,5 mM GlutaMax, pya e oñeñotỹ células diapositivas de vidrio revestida poli-l-lisina rehe (μ-Slide8 Well, Ibidi, número de catálogo 80826) , Ha upéi oñeñongatu 37°C ha 5% CO2-pe 1 aravo aja ikatu haguã umi célula oñemohenda. Ojejapo imagen tiempo real microscopio confocal de escaneo láser Leica SP8 equipado láser blanco, HyD, 63×[1,4 apertura numérica (NA)] lente objetivo aceite ha etapa de calefacción.
Pe ratón pya’e oñeanestesia dióxido de carbono reheve ha oñedecapita, pya’e ojeipe’a iñakãrague akãraguegui, ha oñeikytĩ 200μm ipukukue (experimento de etiquetado 13C-pe guarã) térã 275μm ipukukue (mokõi experimento foton rehegua) sección sagital henyhẽva ko’ã mba’égui Pe helado (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) henyhẽ ko’ã mba’égui: 125 mM ro’ysã hielo-icha, carbono-saturado (95% O2 ha 5% CO2) Ca2 + michĩva líquido cerebroespinal artificial (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucosa, 0,5 mM CaCl2 ha 3,5 mM MgCl2 (presión osmótica 310 ha 330 mmol). Oñembohasa umi apytu’ũ rebanada ojehupytýva peteĩ cámara preincubación rehegua oguerekóva Ca2 + ACSF yvateve (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 ha 2,0 mM MgCl2) Medio) pH 7,4 ha 310 ha 320 mmol).
Pe proceso de imagen aja, umi rebanada oñembohasa peteĩ sala de imagen dedicada-pe, ha ojejapo pe experimento perfusión ACSF continua guýpe temperatura constante 32° a 33°C-pe. Ojeporu microscopio de escaneo láser multifotónico (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) oguerekóva lente objetivo Leica 25x (NA 0,95, y), láser Ti: Zafiro (Chameleon Vision II, Coherent) ojejapo haguã imagen rebanada. Módulo FLIM rehegua (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2 rehegua. Umi cambio estado redox citoplasmático PN-kuérape oñemedi FLIM mokõi foton rupive umi rebanada cerebral sagital-pe, ko'ápe biosensor Grx1-roGFP2 ojepytaso PN-kuéra rehe. Pe capa PN-pe, ojeporavo pe campo adquisición rehegua 50 ha 80 μm rupi pe rebanada superficie guýpe ojeasegura hagua oîha peteî PN viable (he'iséva, ndaipóriha estructura de cuentas térã cambio morfológico neuronal umi dendrita pukukue) ha pe sensor roGFP2 doble positivo ha AAV ocodigáva shRNA PCx térã isecuencia de control (cada uno oexpresa mCherry). Ombyaty taꞌãnga peteĩ pila rehegua 2x zoom digital reheve [onda excitación pukukue: 890 nm; 512 nm 512 píxel]. Detección: ojepuru HyD interno, grupo filtro isotiocianato de fluoresceína (FITC)] ha ta anga promedio 2 a 3 minuto ryepýpe ojehecha hagua oñembyaty hagua suficiente foton (1000 foton en total) ojejapo hagua ajuste curva rehegua. Pe sensibilidad sonda Grx1-roGFP2 ha verificación condición FLIM rehegua ojejapo ojesarekógui valor vida útil roGFP2 rehegua oñembojehe’ávo exógeno 10 mM H2O2 pe perfusión ACSF-pe (oñemomba’eguasu haguã oxidación, osẽva vida útil ojupíva), ha upéi oñembojehe’a 2 mM ditiotreitol (oñemboguejy grado de reducción, osẽva disminución tekove pukukue javeve) (Ta’anga S8, D guive G peve). Eipuru software FLIMfit 5.1.1 ehesa yijo hagua umi resultado ojehupytýva, emohenda hagua pe curva decadencia exponencial petettet ta anga tuichakue rehegua IRF oñemediva ekuépe (función respuesta instrumento rehegua), ha χ2 ha e haimete 1. Ojekalkula hagua petet PN rekove pukukue, ojejapo manualmente pe máscara ojeréva nervio rete rehe, ha ojeporu pe vida promedio petettet máscara-pe oñecuantifika hagua.
Análisis potencial mitocondrial rehegua. Oñeincuba rire sección aguda TMRM 100 nM oñembojehe a directamente ACSF perfundido-pe 30 minuto aja, oñemedi umi cambio potencial mitocondrial PN-kuéra rehegua microscopio mokõi foton rehegua rupive. Ojejapo imagen TMRM oñembohapévo sonda 920 nm-pe ha ojeporúvo HyD interno (tetrametilrodamina isotiocianato: 585/40 nm) oñembyaty haguã señal; oipurúvo peteĩchagua longitud de onda excitación rehegua ha katu ojeporúvo peteĩ HyD interno iñambuéva (FITC :525/50) ojejapo hagua imagen mtYFP. Eipuru ImageJ plug-in Calculadora de Imagen rehegua eevalua hag̃ua potencial mitocondrial nivel celular peteĩvape. Mbykyhápe, ojepuru ecuación plug-in: señal = min (mtYFP, TMRM) ojekuaa hagua región mitocondrial ohechaukáva señal TMRM Purkinje somali-pe pe imagen confocal pila única canal correspondiente-pe. Upéi oñecuantifika área píxel máscara osëvape, ha upéi oñenormalisáva umbral correspondiente imagen pila única canal mtYFP ojehupyty haguã fracción mitocondrial ohechaukáva potencial mitocondrial.
Ko taꞌãngamýi ojedesconvoluciona software Huygens Pro (Imagen de Volumen Científico) rupive. Umi taꞌãnga escaneado azulejo rehegua, ojejapo montaje peteĩ azulejo rehegua ojeporúvo algoritmo de costura automático omeꞌeva software LAS-X. Taꞌãngamýi calibración rire, eipuru ImageJ ha Adobe Photoshop emboguatave hag̃ua taꞌãngamýi ha emohenda peteĩchapa hesakã ha joavy. Eipuru Adobe Illustrator eñembosako’i hag̃ua ta’ãngamýi.
Análisis enfoque ADNmt rehegua. Ojecuantifika mboy lesión ADNmt oî umi sección cerebelosa rehe ojerokyva'ekue anticuerpos ADN rehe microscopio confocal rupive. Ojejapo peteĩteĩva área ojehekahápe célula rete ha núcleo peteĩteĩva célula rehegua, ha ojekalkula pe área respectiva ojeporúvo plug-in Multi Measure (software ImageJ). Jaipe a pe área nuclear pe área célula rete reheguagui jahupyty hagua pe área citoplasmática. Ipahápe, ojeporu plug-in Analyze Particles (software ImageJ) oñecuantifika haguã automáticamente umi punto ADN citoplasmático ohechaukáva ADNmt imagen umbral-pe, ha umi resultado ojehupytýva oñenormalisáva promedio PN umi ratones CTRL-pe. Umi resultado ojehechauka pe número promedio de nucleósidos por célula ramo.
Análisis expresión proteica rehegua. Eipuru ImageJ plug-in Calculadora de Imagen rehegua eevalua hag̃ua expresión proteica PN-pe nivel celular peteĩvape. Mbykyhápe, pe imagen confocal capa única canal correspondiente-pe, ecuación rupive: señal = min (mtYFP, anticuerpo), ojehechakuaa región mitocondrial ohechaukáva inmunoreactividad peteî anticuerpo determinado Purkina-pe. Upéi oñecuantifika área píxel máscara osëvape, ha upéi oñenormalisáva umbral correspondiente imagen pila única canal mtYFP rehe ojehupyty haguã fracción mitocondrial proteína ojehechaukáva.
Análisis de densidad celular Purkinje rehegua. Ojeporu plug-in Contador de células ImageJ rehegua ojehecha hagua densidad Purkinje rehegua ojedividívo mboy célula Purkinjepa ojeipapa pe anillo cerebeloso pukukue rehe oguerekóva umi célula ojeipapava ekue.
Muestra ñembosako’i ha ñembyaty. Umi apytu u grupo control ha umi ratones Mfn2cKO-gui oñefija 2% PFA/2,5% glutaraldehído-pe tampón fosfato 0,1 M (PB)-pe, ha upéi oñembosako i secciones coronal ojeporúvo ciliatos (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) (Espesor 50 a 60 μm) Upéi ojefija tampón PB-pe 1% tetraóxido os-pe ha 1,5% ferrocianuro potasio temperatura ambiente-pe 1 aravo aja. Umi sección ojejohéi mbohapy jey y destilada reheve, ha upéi oñemyatyrõ etanol 70% oguerekóva acetato de uranilo 1% reheve 20 minuto aja. Upéi ojedeshidrata umi sección alcohol graduado-pe ha oñemoinge resina epoxi Durcupan ACM (resina de fundición Araldite M)-pe (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 14040) umi diapositiva de vidrio revestida de silicio mbytépe, ha ipahápe 60°C-pe Polimeriza horno-pe 48 aravo pukukue. Ojeporavo área corteza cerebelosa ha oñeikytï secciones ultrafinas 50 nm Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) rehe ha ojeporavo peteî rejilla hendidura de cobre 2×1 mm revestida película de poliestireno rehe. Umi sección oñemyatyrõ solución acetato de uranilo 4% H2O-pe 10 minuto aja, ojejohéi H2O reheve heta jey, upéi citrato de plomo Reynolds reheve H2O-pe 10 minuto aja, ha upéi ojejohéi H2O reheve heta jey. Ojejapo micrografía microscopio electrónico de transmisión Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) rupive ojeporúvo TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) cámara digital TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, EE.UU.). Alemania).
Umi ratones infectado AAV-pe guarã, ojeipe a apytu’ũ ha oñemboja’o peteĩ sección sagital 1 mm grueso-pe, ha ojehecha cerebelo ojeporúvo microscopio de fluorescencia ojekuaa haguã anillo infectado AAV-pe (he’iséva, mCherry oexpresava). Ojeporu umi experimento añoite oguerekóva inyección AAV osẽva eficiencia transducción yvatetereíva capa celular Purkinje rehegua (he ise haimete capa tuichakue) por lo menos mokõi anillo cerebeloso consecutivo-pe. Pe bucle oñembohasáva AAV rupive ojejapo microdisección ojejapo hagua fijación rire petet pyhare pukukue (4% PFA ha 2,5% glutaraldehído tampón cocoato 0,1 M-pe) ha oñemboguatave. EPON ñembohyrurã, ojejohéi pe tejido fijo tampón cocoato sódico 0,1 M (Applichem) reheve, ha oñeincuba OsO4 2% (os, Servicios de Ciencias; Caco) reheve tampón cocoato sódico 0,1 M (Applichem)-pe 4 Aravo, upéi ojejohéi 2 aravo. Ojejapo jey 3 jey tampón cocamida 0,1 M reheve. Upe rire ojeporu serie ojupíva etanol rehegua oñeincuba hagua petettet solución etanol rehegua 4°C-pe 15 minuto aja ojedeshidrata hagua pe tejido. Pe tejido oñembohasa óxido de propileno-pe ha oñeincuba peteî pyhare pukukue EPON (Sigma-Aldrich)-pe 4°C-pe. Oñemoĩ pe tejido EPON pyahúpe temperatura ambiente-pe 2 aravo aja, ha upéi oñemoinge 62°C-pe 72 aravo aja. Jaipuru ultramicrotomo (Leica Microsystems, UC6) ha kyse diamante (Diatome, Biel, Suiza) ñaikytí hagua secciones ultrafinas 70 nm, ha ñamohe a acetato de uranilo 1,5% reheve 15 minuto aja 37°C-pe, ha ñamohe a solución citrato de plomo reheve 4 minuto. Umi micrografía electronica ojejapo ojeporúvo microscopio electrónico de transmisión JEM-2100 Plus (JEOL) oguerekóva Camera OneView 4K 16 bits (Gatan) ha software DigitalMicrograph (Gatan). Oñeanalisávo ojejogua micrografía electrónica zoom digital 5000× térã 10.000× rupive.
Análisis morfológico mitocondria rehegua. Opaite análisispe g̃uarã, oñembohape manualmente umi contorno mitocondria individual rehegua taꞌãnga digital-pe ojeporúvo software ImageJ. Oñeanaliza umi parámetro morfológico iñambuéva. Densidad mitocondrial ojehechauka porcentaje ojehupytýva ojedividívo área mitocondrial total peteîteî célula rehegua área citoplasma rehe (área citoplasma = área celular-área núcleo celular) × 100. Ojekalkula mitocondria redonda fórmula [4π∙(área/perímetro 2)] rupive. Oñehesa’ỹijo mitocondria morfología ista ha oñemboja’o mokõi categoría-pe (“tubular” ha “ampolla”) según umi forma principal orekóva.
Autofagosoma/lisosoma papapy ha densidad rehegua análisis. Eipuru software ImageJ emohenda hagua manualmente umi contorno petettet autofagosoma/lisosoma rehegua ta anga digital-pe. Autofagosoma/lisosoma área ojehechauka porcentaje ramo ojedividívo área total autofagosoma/lisosoma estructura rehegua petet célula rehegua área citoplasma rehe (área citoplasma=área celular-área núcleo)×100. Ojekalkula pe densidad autofagosoma/lisosoma rehegua oñemboja o rupi pe papapy total mboy estructura autofagosoma/lisosoma rehegua petet célulape (área citoplasmática rehegua) (área citoplasmática = área celular-área nuclear).
Etiquetado sección aguda ha muestra ñembosako’irã. Umi experimento oikotevẽva etiquetado glucosa rehegua, oñembohasa umi agudo cerebral rebanadas peteĩ cámara preincubación-pe, oguerekóva carbono saturado (95% O2 ha 5% CO2), Ca2 + ACSF yvate (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO 3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl 2 ha 2,0 mM MgCl 2, oñemboheko pH 7,4 ha 310 guive 320 mOsm peve), upépe glucosa ha e 13 C 6- Glucosa sustitución (Eurisotop, número de catálogo CLM-1396). Umi experimento oikotevẽva etiquetado piruvato rehegua, oñembohasa umi agudo cerebral rebanadas Ca2 + ACSF yvatevévape (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 ha Oñemoĩ 2,0mM MgCl2, oñemboheko pH 7,4 ha 310 guive 320mOsm peve), ha oñembojehe a 1mM 1-[1-13C]piruvato (Eurisotop, número de catálogo CLM-1082). Oñeincuba umi sección 90 minuto aja 37°C-pe. Opa rire pe experimento, ojejohéi pya e umi sección petet solución acuosa (pH 7,4) oguerekóva carbonato de amonio 75 mM, ha upéi oñehomogeneisa acetonitrilo (ACN) 40:40:20 (v:v:v)-pe: metanol: y. Oñeincuba rire umi sección hielo ári 30 minuto aja, oñecentrifugákuri umi muestra 21.000 g-pe 10 minuto aja 4°C-pe, ha ojejoso pe sobrenadante hesakãva concentrador SpeedVac-pe. Pe pellet metabolito seco osëva oñeñongatu -80°C-pe oñeanalisa peve.
Análisis cromatografía líquida-espectrometría de masa rehegua 13 aminoácido marcado C rehegua. Ojejapo hagua análisis cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) rehegua, oñesuspende jey pe pellet metabolito rehegua 75μl y grado LC-MS-pe (Honeywell). Ojejapo rire centrifugación 21.000 g-pe 5 minuto aja 4°C-pe, ojeporu 20 μl sobrenadante oñemyesakãva análisis flujo aminoácido rehegua, ha pe extracto hembýva katu pya e ojeporu análisis aniónico-pe guarã (ehecha iguýpe). Ojejapo análisis de aminoácidos ojeporúvo protocolo de derivatización cloruro de benzoilo oñemombe u va ekue yma ( 55 , 56 ). Peteĩha etapape, oñembojehe a 10μl carbonato sódico 100 mM (Sigma-Aldrich) 20μl extracto metabolito rehe, ha upéi oñembojehe a 10μl cloruro de benzoilo 2% (Sigma-Aldrich) ACN grado LC-pe. Ojejapo vortex mbykymi pe muestra ha upéi oñecentrifugákuri 21.000 g-pe 5 minuto aja 20°C-pe. Oñembohasa pe sobrenadante oñembogueva ekue petet vial automuestreador 2 ml-pe petet inserto de vidrio cónico reheve (200 μl volumen). Umi muestra oñeanalisa ojeporúvo sistema LC ultra-alto rendimiento Acquity iClass (Waters) oñembojoajúva espectrómetro de masas de precisión alta resolución Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) rehe (Thermo Fisher Scientific). Oñeanalisávo, oñeinyecta 2μl muestra derivada peteî columna T3 sílice 100×1,0 mm mbarete yvate (Y) oguerekóva partícula 1,8μm. Pe caudal ha e 100μl/min, ha pe sistema tampón oguereko tampón A (formato de amonio 10 mM ha ácido fórmico 0,15% ýpe) ha tampón B (ACN). Pe gradiente niko kóicha: 0%B 0 minuto-pe; 0%B rehegua. 0 ha 15% B 0 ha 0,1 minuto-pe; 15 ha 17% B 0,1 ha 0,5 minuto-pe; B 17 ha 55% 0,5 ha 14 minuto-pe; B 55 ha 70% 14 ha 14,5 minuto-pe; 14,5 ha 70 ha 100% B-pe 18 minuto-pe; 100% B 18 ha 19 minuto-pe; 100 ha 0% B 19 ha 19,1 minuto-pe; 0% B 19,1 guive 28 minuto peve (55, 56). Pe espectrómetro de masas QE-HF omba apo modo ionización positiva-pe oguerekóva peteĩ rango de masa m/z (relación masa/carga) 50 ha 750. Pe resolución ojejapóva ha e 60.000, ha pe blanco ion control de ganancia (AGC) ojehupytýva ha e 3×106, ha pe tiempo máximo ion rehegua ha e 100 milisegundos. Pe fuente ionización electrospray hakuáva (ESI) omba apo petet tensión de pulverización 3,5 kV, petet temperatura capilar 250°C, petet flujo de aire vaina 60 AU (unidades arbitrarias), ha petet flujo de aire auxiliar 20 AU. 250°C rupi. Pe lente S oñemohenda 60 AU-pe.
Cromatografía aniónica-Análisis MS rehegua umi ácido orgánico etiquetado 13C rehegua. Pe precipitado metabolito hembýva (55μl) oñeanalisa ojeporúvo sistema de cromatografía iones Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) oñembojoajúva espectrómetro de masas QE-HF (Thermo Fisher Scientific) rehe. Mbykyhápe, oñeinyecta 5μl extracto metabolito peteî columna Dionex IonPac AS11-HC equipada HPLC (2 mm×250 mm, tamaño de partícula 4μm, Thermo Fisher Scientific) modo bucle parcial empuje-in orekóva relación de relleno 1. )on. Dionex IonPac AG11-HC columna guardia rehegua (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Pe temperatura columna rehegua oñemantene 30°C-pe, ha pe automuestreador oñemohenda 6°C-pe. Eipuru petet cartucho hidróxido de potasio rehegua oñeme eva y desionizado reheve ojejapo hagua petet gradiente hidróxido potasio rehegua generador eluyente rupive. Separación metabolito rehegua petet caudal 380μl/min-pe, ojejapo hagua ko a gradiente: 0 a 3 minuto, 10 mM KOH; 3 ha 12 minuto, 10 ha 50 mM KOH; 12 ha 19 minuto, 50 ha 100 mM KOH; 19 ha 21 minuto , 100 mM KOH; 21 ha 21,5 minuto, 100 ha 10 mM KOH. Ojeequilibra jey pe columna 10 mM KOH guýpe 8,5 minuto aja.
Umi metabolito eluido oñembojoaju petet corriente suplemento isopropanol 150μl/min reheve columna rire ha upéi ojedirigi espectrómetro de masas de alta resolución omba apóva modo de ionización negativa-pe. MS ojesareko oikóvo rango de masa m/z 50 guive 750 peve orekóva resolución 60.000. AGC oñemohenda 1×106-pe, ha pe tiempo máximo ion rehegua oñeñongatu 100 ms-pe. Pe fuente ESI oñembohapéva ojeporu tensión de pulverización 3,5 kV-pe. Umi ambue configuración fuente iones rehegua ha e ko a mba e: temperatura capilar 275°C; flujo gas vaina rehegua, 60 AU; flujo de gas auxiliar, 20 AU 300°C-pe, ha lente S oñemohenda 60 AU-pe.
Análisis de datos umi metabolito etiquetado 13C rehegua. Eipuru software TraceFinder (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific) ojejapo hagua análisis de datos relación isótopo rehegua. Ojeverifika identidad peteîteî compuesto peteî compuesto de referencia ojeroviakuaáva ha oñeanalisa independientemente. Ojejapo hagua análisis enriquecimiento isótopo rehegua, ojeipe a [M + H] +-gui pe área cromatograma de iones extraídos (XIC) petet isótopo 13C (Mn) rehegua, upépe n ha e pe número de carbono compuesto diana rehegua, ojeporúva oñeanalisa hagua aminoácido téra [ MH] + ojepuru oñeanalisa hagua aniones. Pe precisión masa rehegua XIC rehegua sa ive cinco parte por millóngui, ha pe precisión RT rehegua ha e 0,05 minuto. Pe análisis enriquecimiento rehegua ojejapo ojekalkula rupi pe relación petettet isótopo ojejuhúva rehegua pe suma opaite isótopo compuesto correspondiente rehegua ndive. Ko a relación oñeme e valor porcentual ramo petet isótopo rehegua, ha umi resultado ojehechauka enriquecimiento porcentual molar (MPE) ramo, oje e haguéicha yma (42).
Pe pellet neurona congelado oñehomogeneisa metanol 80% ro’ysã hielo-icha (v/v), ojejapo vortex ha oñeincuba -20°C-pe 30 minuto aja. Ojevórtece jey pe muestra ha oñembopupu +4°C-pe 30 minuto aja. Pe muestra oñecentrifugákuri 21.000 g-pe 5 minuto aja 4°C-pe, ha upéi oñembyaty pe sobrenadante osêva ha ojejoso ojeporúvo concentrador SpeedVac 25°C-pe ojejapo hagua análisis upe rire. Oje e haguéicha yvateve, ojejapo análisis LC-MS umi aminoácido umi célula oñemboja o va ekue rehe. Oipurúvo TraceFinder (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific), ojejapo análisis de datos ojeporúvo masa monoisótópica peteĩteĩva compuesto rehegua. Ojejapo normalización cuantil umi dato metabolito rehegua ojeporúvo paquete software preprocessCore ( 57 ).
Rebanada ñembosako’i. Pya’e oñeanestesia pe ratón dióxido de carbono reheve ha oñedecapita, pya’e ojeipe’a iñakãrague iñakãraguegui, ha ojeporu pe kyse vibrante henyhẽva hielo-gui (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) oñeikytĩ haguã 300 a 375 μm secciones sagital-pe Gasificación de carbono ro’ysã (95% O2 ha 5% CO2) Ijyvate Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 ha 6,0 mM MgCl2 Oñemohenda pH 7,4 ha 310 guive 330 mOsm peve). Oñembohasa umi apytu’ũ rebanada ojehupytýva peteĩ cámara oguerekóva Ca2 + ACSF yvateve (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampón fosfato sódico, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 4,0 mM CaCl2 ha mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 ha 310 ha 320 mOsm peve). Eñongatu umi rebanada 20 térã 30 minuto ikatu hag̃uáicha oñemoĩ jey ojegrava mboyve.
grabación rehegua. Opaite grabación-pe ojeporu peteĩ etapa microscopio rehegua oguerekóva peteĩ cámara de grabación fija ha peteĩ lente objetivo de inmersión a agua 20x (Scientifica). Umi célula Purkinje putativa ojehechakuaa (i) hete tuichakue, (ii) ubicación anatómica cerebelo rehegua, ha (iii) expresión gen reportero mtYFP fluorescente rehegua. Pe pipeta parche orekóva resistencia punta 5 a 11 megohms ojeipe a petet capilar de vidrio borosilicato (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Alemania) ha petet pipeta horizontal Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Opaite grabación ojejapo amplificador de abrazadera parche npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Alemania), oñecontroláva software Signal (versión 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Reino Unido) rupive. Pe experimento ojeregistra peteĩ tasa de muestreo 12,5 kHz-pe. Pe señal ojefiltra mokõi filtro Bessel de paso mbyky reheve orekóva frecuencia de corte 1,3 ha 10 kHz peteĩteĩ. Pe capacitancia membrana ha pipeta rehegua oñecompensa circuito compensación rehegua rupive ojeporúvo amplificador. Opaite experimento ojejapo cámara Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Alemania) poguýpe, oñekontroláva software Hokawo rupive (versión 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemania).
Configuración ha análisis rutinario célula entera rehegua. Ojegrava mboyvemi, oñemyenyhe pipeta pe solución hyepypegua oguerekóva ko a sustancia: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM gluconato potásico, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosina trifosfato (GTP) (Na) ha Ojejapo 10,0 mM creatinina fosfato pH 7,25 peve, ha pe presión osmótica ha e 290 mOsm (sacarosa). Ojejapo riremínte petet fuerza 0 pA ojeruptura hagua pe membrana, oñemedi pe potencial membrana opytu u hagua. Pe resistencia entrada rehegua oñemedi ojejapo rupi corriente hiperpolarizada -40, -30, -20 ha -10 pA. Ñamedi pe magnitud ombohováiva tensión ha jaipuru léi Ohm rehegua jaikuaa hagua pe resistencia entrada rehegua. Ojeregistra actividad espontánea petet abrazadera de tensiónpe 5 minuto aja, ha ojehechakuaa ha oñemedi sPSC Igor Pro-pe (versión 32 7.01, WaveMetrics, Lago Oswego, Oregón, EE.UU.) ojeporúvo script reconocimiento semiautomático. Pe curva IV ha corriente estado estacionario oñemedi ojeabraza rupi pe batería potencial iñambuévape (oñepyrũvo -110 mV guive) ha oñembohetave pe tensión 5 mV paso-pe. Ojehechákuri pe producción AP rehegua ojejapo rupi petet corriente despolarizante. Ojeabraza pe célula -70 mV-pe ojejapo aja petet pulso corriente despolarizante rehegua. Oñemohenda pe paso tuichakue peteĩteĩva unidad de grabación rehegua por separado (10 guive 60 pA peve). Jakalkula frecuencia AP máxima jaipapavo manualmente umi pico pulso rehegua omoheñóiva frecuencia AP ijyvatevéva. Umbral AP oñeanalisa ojeporúvo mokõiha derivado pulso despolarización rehegua ombohapéva raẽ peteĩ térã hetave AP.
Configuración ha análisis parche perforado rehegua. Ejapo grabación parche perforada rehegua eipurúvo protocolo estándar. Eipuru petet pipeta ndoguerekóiva ATP ha GTP ndoguerekóiva ko a mba e: gluconato K 128 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM, EGTA 0,1 mM ha MgCl2 2 mM, ha emohenda pH 7,2 peve (ojeporúvo KOH). Ojeheja rei ATP ha GTP pe solución intracelular-gui ani hagua ojejoko permeabilidad ndojejokóiva membrana celular rehegua. Pe pipeta parche rehegua oñemyenyhẽ peteĩ solución interna oguerekóva anfotericina (haimete 200 ha 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) ojehupyty haguã peteĩ registro pe parche perforado rehegua. Ojejoso anfotericina sulfóxido de dimetilo-pe (concentración paha: 0,1 a 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Pe concentración DMSO ojeporúva ndorekói efecto significativo umi neuronas oñeestudiáva rehe. Pe proceso de puñetazo aja, ojesareko meme pe resistencia canal (Ra) rehe, ha oñepyrü experimento oñeestabiliza rire amplitud Ra ha AP (20-40 minutos). Ojemedi actividad espontánea petet abrazadera tensión ha/térã corriente-pe 2 a 5 minuto aja. Ojejapo análisis de datos ojeporúvo Igor Pro (versión 7.05.2, WaveMetrics, EE.UU.), Excel (versión 2010, Microsoft Corporation, Redmond, EE.UU.) ha GraphPad Prism (versión 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Tetã peteĩ reko Amérikagua). Ojekuaa hag̃ua umi AP espontáneo, ojepuru IgorPro NeuroMatic v3.0c plug-in. Oikuaauka ijeheguiete umi AP oipurúvo peteĩ umbral oñemeꞌevaꞌekue, oñemboheko peteĩteĩva peteĩteĩva registro-pe g̃uarã. Jaipurúvo intervalo de pico, jaikuaa frecuencia pico rehegua oguerekóva frecuencia pico instantánea máxima ha frecuencia pico promedio rehegua.
PN aislamiento rehegua. Ojeadaptáva protocolo oñemoherakuãva'ekue yma, PNs oñembopoty cerebelo ratón-gui peteî etapa especificada ( 58 ). Mbykyhápe, ojedisecciona ha oñembojy pe cerebelo medio de disociación ro ysã hieloicha [HBSS Ca2+ ha Mg2+ ÿre, oñembojoapy glucosa 20 mM, penicilina (50 U/ml) ha estreptomicina (0,05 mg/ ml)], ha upéi ojedigesti pe medio papaínape [HBSS, oñembojoapýva 1-cisteína·HCl reheve (1 mg / ml), papaína (16 U / ml) ha desoxirribonucleasa I (ADNasa I; 0,1 mg/ml)] Oñemongu’e 30 minuto aja 30°C-pe. Ñepyrũrã ojejohéi umi tejidos medio HBSS oguerekóva moco de huevo (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ha DNasa (0,1 mg/ml) temperatura ambiente-pe ani hagua digestión enzimática, ha upéi medio HBSS oguerekóva glucosa 20 mM-pe Oñemolina mbeguekatu HBSS, penicilina (50 U/ml), estreptomicina (0,05 mg/ml) ha ADNasa (0,1 mg/ml) omosãso umi célula peteĩva. Pe suspensión celular osëva ojefiltra colador celular 70μm rupive, upéi ojejapo pellet umi célula centrifugación rupive (1110 rpm, 5 minutos, 4°C) ha oñesuspende jey medio de clasificación-pe [HBSS, oñembohetavéva glucosa 20 mM, 20% bovino fetal ) Suero, penicilina (50 U/ml) ha estreptomicina (0,05 mg/ml)] rehegua; oevalua viabilidad celular yoduro de propidio reheve ha omohenda densidad celular 1×106 guive 2×106 célula/ml peve. Ojejapo mboyve citometría de flujo, ojefiltra pe suspensión petet colador celular 50 μm rupive.
Citometro de flujo rehegua. Ojejapo clasificación celular 4°C-pe ojeporúvo máquina FACSAria III (BD Biosciences) ha software FACSDiva (BD Biosciences, versión 8.0.1). Pe suspensión celular oñemboja o ojeporúvo petet boquilla 100 μm petet presión 20 psi guýpe petet velocidad ~2800 eventos/seg. Umi criterio tradicional de gating (tamaño celular, discriminación bimodal ha característica dispersión) ndikatúi oasegura aislamiento correcto PN ambue tipo de célula-gui, estrategia de gating oñemohenda oñemopyendáva ombojojávo directo intensidad ha autofluorescencia YFP mitoYFP+ ​​ha mitoYFP − Ratones control. YFP oñembopy'aguasu oñeirradia rupi muestra línea láser 488 nm reheve, ha ojehechakuaa señal ojeporúvo filtro de paso banda 530/30 nm. Umi ryguasu mitoYFP+-pe, ojeporu avei mbarete relativo gen momaranduhára Rosa26-mitoYFP ojehechakuaa haguã umi fragmento hete neuronal ha axónico. 7-AAD oñembopy'aguasu láser hovy 561 nm reheve ha ojehechakuaa filtro de paso de banda 675/20 nm rupive oñemboyke hagua célula omanóva. Ojesepara hagua astrocitokuéra petet jave, oñemyatyrõ suspensión celular ACSA-2-APC reheve, upéi oñeirradia pe muestra línea láser 640 nm reheve, ha ojeporu filtro de paso de banda 660/20 nm ojehechakuaa hagua señal.
Umi célula oñembyatýva ojejapo pellet centrifugación rupive (1110 rpm, 5 minutos, 4°C) ha oñeñongatu -80°C-pe ojeporu peve. Umi ratones Mfn2cKO ha umi cachorro de basura oñemboja'o peteî árape ikatu haguã ominimisa variabilidad procesal. Ojejapo ha oñehesa’ỹijo dato FACS rehegua ojeporúvo software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregón, EE.UU.).
Oje’e haguéicha yvateve (59), ojeporu PCR tiempo real-pe ojeipe’a haguã ADN umi neuronas clasificada-gui, ojejapo haguã cuantificación ADNmt upe rire. Oñeha’ã iñepyrũrã linealidad ha sensibilidad umbral rehegua ojejapo rupi qPCR opaichagua célula rehe. Mbykyhápe, ñambyaty 300 PN petet tampón de lisispe oguerekóva 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 ha proteinasa K (200 ng/ml) ha ñaincuba 55°C-pe 120 minuto. Umi célula oñeincubave 95°C-pe 10 minuto aja ojeasegura hagua inactivación completa proteinasa K. Ojepurúvo sonda TaqMan (Thermo Fisher) específica mt-Nd1-pe, oñemedi ADNmt PCR semicuantitativa rupive sistema 7900HT Real-Time PCR-pe (Thermo Fisher Scientific). Ciencia, catálogo número Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, catálogo número AIVI3E8) ha 18S (Thermo Fisher Scientific, catálogo número Hs99999901_s1) genes.
Proteoma muestra ñembosako’i. Oñemohe’ẽvo solución 95°C-pe 10 minuto ha oñesonica, tampón de lisis-pe [cloruro de guanidina 6 M, clorhidrato de tris(2-carboxietil) fosfina 10 mM, cloroacetamida 10 mM ha pellets neuronas congelados tris- Lise 100 mM HCl-pe]. Bioruptor (Diagenode) ári 10 minuto aja (30 segundo pulso / 30 segundo periodo de pausa). Pe muestra ojedilui 1:10 tris-HCl 20 mM (pH 8,0)-pe, oñembojehe a 300 ng oro tripsina (Promega) rehe, ha oñeincuba pyhare pukukue 37°C-pe ojehupyty hagua digestión completa. Mokõiha árape oñecentrifugákuri pe muestra 20.000 g-pe 20 minuto aja. Pe sobrenadante ojedilui ácido fórmico 0,1% reheve, ha ojedesa pe solución StageTips ojejapóva ijehegui. Pe muestra ojejoso petet instrumento SpeedVac-pe (concentrador Eppendorf más 5305) 45°C-pe, ha upéi oñesuspende pe péptido ácido fórmico 0,1%-pe. Opaite muestra oñembosako i simultáneamente peteĩ tapicha rupive. Oñeanalisávo muestra astrocito rehegua, oñembohéra 4 μg péptido desalido peteĩ etiqueta masa tándem reheve (TMT10plex, número de catálogo 90110, Thermo Fisher Scientific) orekóva relación péptido ha reactivo TMT 1:20. Ojejapo hagua etiquetado TMT rehegua, oñesuspende jey 0,8 mg reactivo TMT 70 μl ACN anhidro-pe, ha oñembojehe a jey pe péptido seco 9 μl TEAB 0,1 M (bicarbonato de trietilamonio)-pe, upévape oñembojehe a 7 μl reactivo TMT ACN-pe. Ko concentración ha'e 43,75%. Ojejapo rire 60 minuto, oñembogue pe reacción 2 μl hidroxilamina 5% reheve. Oñembyaty umi péptido etiquetado, ojejoso, oñesuspende jey 200μl ácido fórmico 0,1% (FA)-pe, oñemboja o mokõime ha upéi ojedessalta ojeporúvo StageTips ojejapóva ijehegui. Oipurúvo cromatógrafo líquido ultra alto rendimiento UltiMate 3000 (cromatógrafo líquido ultra alto rendimiento UltiMate 3000), peteĩva umi mokõi mitad oñefracciona peteĩ columna cromatográfica Acquity 1mm x 150mm rehe henyhẽva partículas C18 130Å1.7μm-gui (Waters, catálogo No. SKU: 186006935). Termo Fisher Científico rehegua). Ojesepara umi péptido petet caudal 30μl/min-pe, ojeipe a 1% guive 50% peve tampón B 85 minuto aja gradiente paso a paso reheve 96 minuto, 50% guive 95% peve tampón B 3 minuto aja, upéi 8 minuto 95 % tampón B peve; Tampón A ha e 5% ACN ha 10 mM bicarbonato de amonio (ABC), ha tampón B ha e 80% ACN ha 10 mM ABC. Ñambyaty fracción káda 3 minuto ha ñambojoaju mokôi atýpe (1 + 17, 2 + 18, hamba e) ha jajoso centrífuga de vacíope.
Análisis LC-MS/MS rehegua. Espectrometría de masas-pe guarã, ojesepara umi péptido (número r119.aq) peteĩ columna analítica PicoFrit 25 cm, diámetro interior 75 μm rehe (lente objetivo pyahu, número de parte PF7508250) oguerekóva 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medio (Dr. Maisch, mat), ojeporu medio EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alemania retãme). Pe columna oñemantene 50°C-pe. Umi tampón A ha B ha e 0,1% ácido fórmico ýpe ha 0,1% ácido fórmico 80% ACN-pe, petettet. Ojesepara péptido gradiente paso a paso 200 nl/min 6% guive 31% tampón B peve 65 minuto aja, ha 31% guive 50% tampón B peve 5 minuto aja. Umi péptido ojeeluíva oñeanalisa espectrómetro de masas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific) rupive. Ojejapo medición precursor péptido m/z orekóva resolución 120.000 oîva rango 350 ha 1500 m/z. Oipurúvo 27% energía de colisión normalizada, ojeporavo precursor imbaretevéva orekóva estado de carga 2 a 6 escisión disociación trampa C (HCD) energía yvate rehegua. Pe tiempo ciclo rehegua oñemohenda 1 s-pe. Ojemedi pe valor m/z pe fragmento péptido rehegua pe trampa de iones-pe ojeporúvo pe blanco AGC michĩvéva 5×104 ha pe tiempo máximo inyección rehegua 86 ms. Ojejapo rire fragmentación, oñemoĩ pe precursor lista de exclusión dinámica-pe 45 s aja. Ojesepara umi péptido marcado TMT peteî columna Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo 164942), ha oñeanalisa espectro migración espectrómetro de masas Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) equipado equipo iones de forma de ondas asimétricas de alto campo (FAIMS). (Thermo Fisher Scientific) ombaꞌapo mokõi tensión compensación rehegua −50 ha −70 V. MS3 ojeporavóva oñemopyendáva precursor de sincronización rehe ojeporu medición señal iones informe TMT-pe g̃uarã. Pe separación péptido rehegua ojejapo EASY-nLC 1200 rehe, ojeporúvo elución gradiente lineal 90%, oguerekóva concentración tampón 6% ha 31%; tampón A ha e 0,1% FA, ha tampón B ha e 0,1% FA ha 80% ACN. Pe columna analítica ojeporu 50°C-pe. Eipuru FreeStyle (versión 1.6, Thermo Fisher Scientific) embojaꞌo hag̃ua archivo original según pe tensión compensación FAIMS rehegua.
Proteína jehechakuaa ha oñemboheko. Oipurúvo motor de búsqueda integrado Andromeda, oñehesa’ỹijo umi dato original ojeporúvo MaxQuant versión 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Ojekuaa avei umi secuencia Cre recombinasa ha YFP ojehupytýva Aequorea victoria-gui, ojeheka espectro fragmento péptido rehegua secuencia canónica ha secuencia isoforma proteoma referencia ratón rehegua (Proteoma ID UP000000589, ojegueru UniProt-gui jasypokõi 2017-pe) . Oñemohenda oxidación metionina ha acetilación proteína N-terminal modificación variable ramo; metilación carbamoilo cisteína rehegua oñemohenda modificación fija ramo. Umi parámetro digestión rehegua oñemohenda “especificidad” ha “tripsina/P”-pe. Pe péptido ha péptido navajas ojeporúva ojekuaa hagua proteína ha e 1; pe número mínimo péptido ijojaha'ỹva ha'e 0. Umi condición ojoajúva mapa péptido rehe, tasa de identificación proteica ha'e 0,01. Ojeactiva pe opción “Mokõiha Péptido”. Eipuru opción “match between runs” embohasa hag̃ua umi identificación osẽ porãva opaichagua archivo original apytépe. Eipuru LFQ ratio mínimo conteo 1 cuantificación sin etiqueta (LFQ) rehegua (60). Pe LFQ intensidad ojefiltra por lo menos mokõi valor válido por lo menos peteĩ grupo genotipo-pe peteĩteĩ punto de tiempo-pe, ha ojeextrapola peteĩ distribución normal-gui orekóva ancho de. 0,3 ha oguejy 1,8. Eipuru plataforma informática Perseus (https://maxquant.net/perseus/) ha R (https://r-project.org/) ehesa’ỹijo hag̃ua LFQ rembiapokue. Ojeporu peteĩ prueba t moderada mokõiha tape rehegua oúva paquete software limma-gui ojejapo haguã análisis de expresión diferencial ( 61 ). Ojejapo análisis de datos exploratorio ojeporúvo ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ha pheatmap. Umi dato proteómica TMT rehegua oñehesa’ỹijo ojeporúvo MaxQuant versión 1.6.10.43. Ojeheka dato proteómica cruda base de datos proteómica humana UniProt-gui, ojegueru setiembre 2018. Ko análisis oike factor de corrección pureza isótopo ome'ëva fabricante. Eipuru limma R-pe ojejapo hagua análisis de expresión diferencial. Umi dato ypykue, base de datos jeheka resultado ha datokuéra jesareko rembiapo ha resultado opaite oñeñongatu alianza ProteomeXchange-pe PRIDE socio ryru rupive identificador conjunto de datos PXD019690 reheve.
Umi anotación funcional ombohetave pe análisis. Ojeporu tembipuru Análisis de Ruta de Ingenio (QIAGEN) ojekuaa hagua mba eichaitépa oĩ umi término anotación funcional umi dato oñemboguapyva ekue 8 arapokõindýpe (Ta anga 1). Mbykyhápe, ojeporu lista cuantitativa proteica ojehupytýva análisis de datos LC-MS/MS (espectrometría de masas tándem)-gui ko'ã criterio filtro reheve: Mus musculus ojeporavo especie ha antecedente ramo, ha categoría ohechauka valor P omohendava'ekue Benjamini enriquecimiento 0,05 térã mbovyvéva ojehecha significativo. Ko gráfico-pe g̃uarã ojehechauka umi po categoría exceso yvategua peteĩteĩva clúster-pe oñemopyendáva valor P ajustado rehe. Oipurúvo prueba t múltiple, ojeporúvo programa de impulso lineal mokõi etapa Benjamini, Krieger ha Yekutieli (Q = 5%), ojejapo análisis de expresión proteica curso tiempo umi candidato importante ojehechakuaáva cada categoría-pe, ha oñeanalisa cada fila por separado. Natekotevẽi ojeadopta peteĩ SD constante.
Oñembojoja hagua umi resultado ko estudio rehegua umi base de datos oñemoherakuãva ndive ha rogenera peteî diagrama Venn figura 1-pe, rombojoaju lista proteica cuantitativa anotaciones MitoCarta 2.0 ndive ( 24 ). Eipuru tembipuru internet-pegua Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) emoheñói hag̃ua pe diagrama.
Ojekuaa hagua marandu detallado umi procedimiento estadístico ojeporúva análisis proteómica rehegua, ojehechava era sección correspondiente Materiales y Métodos rehegua. Opaite ambue experimento-pe guarã, ikatu ojejuhu marandu detallado leyenda correspondiente-pe. Ndoje’éiramo ambue mba’e, opaite dato ojehechauka media ± SEM ramo, ha opaite análisis estadístico ojejapo software GraphPad Prism 8.1.2 rupive.
Umi material suplementario ko artículo-pe g̃uarã, ehecha http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
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Ohai E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson rehegua
Análisis proteómico neuronas disfuncionales rehegua ohechauka umi programa metabólico oñeactivaha ombohovái haguã neurodegeneración.
Ohai E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson rehegua
Análisis proteómico neuronas disfuncionales rehegua ohechauka umi programa metabólico oñeactivaha ombohovái haguã neurodegeneración.
©2020 Asociación Americana para el Avance de la Ciencia rehegua. opaite derecho ojeguerekóva. AAAS ha’e peteĩ socio HINARI, AGORA, OARE, CORO, CLOCKSS, CrossRef ha CONTADOR. CienciaAvances ISSN 2375-2548 rehegua.