Pe clasificación proteica vía secretora-pe iñimportanteterei oñemantene haguã compartimentación celular ha homeostasis. Oĩve pe clasificación mediada concha rupive, pe rol orekóva umi lípido clasificación kinesina-pe pe proceso de transporte secreto-pe ha’e peteĩ porandu básico ymaite guive oúva ha ne’ĩrava gueteri oñembohovái. Ko ápe, rojapo 3D simultáneo multicolor multicolor alta resolución imagen tiempo real rohechauka haguã in vivo umi proteína oñesintetiza pyahúva glicosilfosfatidilinositol-inmovilizado orekóva fracción lípido ceramida ipukuetereíva oñemboja'o ha oñemboja'o endoplasia especializada Sitio de salida neta, iñambuéva oiporúvagui umi proteína transmembrana. Avei, rohechauka pe cadena ipukukue ceramida rehegua membrana retículo endoplásmico-pe ha e crítico ko selectividad clasificación rehegua. Ore estudio ome'ë peteîha evidencia directa in vivo oklasifika haguã carga proteica oñemopyendáva cadena lípida pukukue umi sitio selectivo exportación vía secretora-pe.
Umi célula eucariota-pe, umi proteína oñesintetizava ekue retículo endoplásmico (ER)-pe, upéi oñemboja o ojegueraha aja pe vía secretora rupive oñeme e hagua destino celular apropiado-pe (1). Además de la clasificación mediada por capa, are guivéma ojeespekula ciertos lípidos ikatuha avei oservi punto de salida selectivo ramo ombojoajúvo umi dominio membrana específico-pe umi proteína específica (2-5). Ha katu ndaipóri gueteri evidencia directa in vivo ohechauka haguã ko posible mecanismo basado lípido-pe. Ikatu haguãicha oñesolusiona ko problema básico, roestudia levadura-pe mba'éichapa ojeexporta diferencialmente umi proteína anclada glicosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-APs) ER-gui. GPI-APs ha e opaichagua proteína superficial celular ojoajúva lípido rehe ( 6, 7). GPI-AP ha'e peteĩ proteína ojeipe'áva oñembojoajúva umi hogue okápe membrana plasmática rehe pe fracción glicolípida (ancla GPI) rupive. Oasepta hikuái umi ancla GPI ha'éva modificación post-traduccional conservadora lumen ER-pe (8). Ojejoko rire, GPI-AP ohasa aparato Golgi rupive (5, 9) ER guive membrana plasmática peve. Oĩramo umi ancla GPI ojapo GPI-AP ojegueraha hag̃ua aparte umi proteína ojesecretávagui transmembrana rupive (oikehápe ambue proteína membrana plasmática rehegua) pe tape secretora pukukue ( 5 , 9 , 10 ). Umi célula levadura rehegua, umi GPI-AP ojeipe a ambue proteína ojesecretávagui retículo endoplásmico-pe, ha upéi oñembohyru vesícula ijojaha yvape oñembojeguáva complejo proteico capa II (COPII) rupive (6, 7). Umi determinante ko proceso de clasificación proceso de exportación ER-pe nahesakãi, pero ojeespekula ko mecanismo ikatuha oikotevê lípido, especialmente remodelación estructural porción lípida ancla GPI ( 5 , 8 ). Levadura-pe, oñepyrü remodelación lípido GPI rehegua oñembojoaju riremínte GPI, ha heta kásope, ojapo ceramida ojoaju hagua ácido graso saturado cadena puku 26 carbono rehegua (C26:0) (11, 12). Ceramida C26 ha'e pe ceramida principal omoheñóiva célula levadura ko'ágã peve. Oñesintetiza ER-pe ha hetave ojegueraha aparato Golgi-pe vesícula COPII rupive (13). Pe exportación ER GPI-AP rehegua oikotevẽ específicamente síntesis ceramida rehegua oñemotenondéva ( 14 , 15 ), ha a su vez, pe conversión ceramida ceramida fosfato inositol (IPC)-pe aparato Golgi-pe odepende síntesis ancla GPI rehe ( 16 ). Umi estudio biofísico membrana artificial rehegua ohechauka umi ceramida cadena acil ipukuetereíva ikatuha oñembojoaju ojapo hagua dominio ordenado orekóva propiedad física ijojaha yva ( 17 , 18 ). Ko'ã dato ogueru hipótesis ceramida C26 ha GPI-AP ceramida C26 ndive oiporúva propiedad física oñembojoaju haguã región térã región ordenada entorno lípido membrana ER relativamente sarambikuépe. Ojejapove umi glicerolípido mbyky ha insaturado-gui (C16:1 ha C18:1) (19, 20). Ko'ã región oñecentráta selectivamente umi sitio específico de salida ER (ERES), ikatuhápe ojegueraha co-transporte GPI-AP basado ceramida ha ceramida Golgi-pe peteî vesícula COPII dedicada-pe (5).
Ko estudio-pe, ro’examina directamente ko mecanismo basado lípido rehegua roiporúvo microscopía de imagen confocal en tiempo real súper resolución (SCLIM), ha’éva peteĩ técnica microscopía de punta ikatúva ohechakuaa simultáneamente proteína etiquetada fluorescente Umi ta’anga mbohapy color ha mbohapy dimensión (3D) oguereko resolución ha velocidad yvatetereíva célula oikovévape (21, 22).
Roipuru raẽ tecnología SCLIM rodefinive haguã mba'éichapa ojehecha GPI-AP normal orekóva grupo ceramida C26 umi proteína secretada transmembrana-gui osê rire ER S. cerevisiae-pe. Ikatu haguã ojehecha clasificación ER, roiporu sistema genético ikatúva ohecha directamente carga pyahu oñesintetizava oikéva ERES in vivo ( 7 , 23 ). Carga ramo, roiporavo C26 ceramida-based GPI-AP Gas1 etiquetado proteína fluorescente verde (GFP) ha proteína transmembrana secretada Mid2 etiquetada proteína fluorescente infrarroja cercana (iRFP), mokõivéva ojepytasóva membrana plasmática ( 24-26 ). Pe mutante sec31-1 temperatura-pe, ko'ã mokõi carga ojehechauka peteî promotor inducible galactosa-pe ha peteî marcador ERES constitutivo guýpe. Pe temperatura extrema (37°C), pe mutación sec31-1 ohypýigui función componente capa COPII Sec31 ombotove haguã germinación COPII ha exportación ER, carga pyahu oñesintetiza oñembyaty ER-pe (23). Oñembopiro y rire temperatura ijyvatévape (24°C), umi célula mutante sec31-1 ojerrekupera área secretora-gui, ha oñepyrũ ojegueraha ER-gui pe carga sintética pyahu oñembyatýva. CLIM jehechauka ohechauka hetaveha umi Gas1-GFP ha Mid2-iRFP oñesintetiza pyahúva oñembyaty gueteri ER-pe umi célula mutante sec31-1-pe oñeincuba rire 37°C-pe ha upéi ojepoi 24°C-pe 5 minuto aja (Ta anga 1). Mid2-iRFP oñemosarambígui membrana ER tuichakue javeve, ha Gas1-GFP oñeconcentra ha oñembyaty área membrana ER discontinua-pe, iñambueite iñemosarambi (Ta anga 1, A guive C peve ha Película S1). Avei, ojehechaháicha ta anga 1D-pe, pe clúster Gas1-GFP ndorekói Mid2-iRFP. Ko'ã resultado ohechauka GPI-AP ha proteína transmembrana ojeipe'a iñambuéva región membrana ER iñepyrüme. Pe clúster Gas1-GFP ojoaju peteĩ ERES específico rehe ojerokyva mCherry proteína capa COPII Sec13 reheve (Figura 1, E ha F, ha película S1) (23).
umi célula sec31-1 oikuaauka secreciones inducidas galactosa rupive, peteĩ cadena acil puku (C26) ceramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verde) ha proteína transmembrana Mid2-iRFP (TMP, hovy) ha ko ERES Constructivo etiquetado Sec13-mCherry (ERES, magenta) oñeincuba 37°C-pe 30 minutos, oñembohasa 24°C, ha ta’anga SCLIM rupive 5 minuto rire. (A guive C peve) ohechauka petet ta anga 2D oñembojoajúva téra petettet representativa petet plano rehegua (A), petet ta anga proyección 2D rehegua 10 z-sección rehegua (B) téra petet ta anga hemisferio celular 3D rehegua umi marcador carga ha ERES rehegua (C). Barra escala rehegua 1μm (A ha B). Pe unidad escala rehegua ha e 0,551μm (C). Ojehechakuaa Gas1-GFP región ER discreta térã clúster-pe, ha katu Mid2-iRFP ojehechakuaa ha oñemyasãi membrana ER pukukue (C). (D) Pe gráfico ohechauka intensidad relativa fluorescencia rehegua Gas1-GFP ha Mid2-iRFP clúster Gas1-GFP-pe línea flecha morotî pukukue (izquierda). AU, unidad arbitraria rehegua. (E ha F) ohechauka ta anga 3D ombojoajúva umi mba e ha marca ERES. Ojehechakuaa umi clúster Gas1-GFP ERES específico ypýpe. Pe unidad escala rehegua ha e 0,551μm. (F) Pe flecha sólida morotĩva omarká pe clúster Gas1-GFP ojoajúva ERES rehe. Umi panel mbytépe ha akatúa gotyo ohechauka taꞌãnga 3D oñembotuicháva oñembojoajúva ha peteĩ jehecha ojeréva clúster Gas1-GFP ojeporavóva rehegua.
Pe relación espacial estrecha oîva clúster Gas1-GFP ha peteî ERES específico apytépe ohechauka Gas1-GFP ikatuha oike ERES selectivo-pe, iñambuéva selectividad oiporúva Mid2-iRFP osê haguã ER-gui. Oñembohovái hagua ko posibilidad, rocuantifika pe relación ERES petet téra mokôi mba e rehe añoite (Ta anga 2, A guive C peve). Rojuhu hetave ERES (70%) oguerekoha peteî tipo de carga añoite. Ta anga iguypegua ta anga 2C ohechauka mokõi techapyrã típico ERES rehegua oguerekóva Gas1-GFP añoite (Ta anga 1) térã Mid2-iRFP añoite (Ta anga 2). Ojoavy, haimete 20% ERES oreko mokõi carga oñembojoajúva peteî área-pe. Ojejuhu oîha ERES (10%) oguerekóva mokõi tipo de carga, pero ojeipe'a hikuái área hesakã porãvape iñambuéva. Upévare, ko análisis estadístico ohechauka ojegueraha rire ER, GPI-AP Gas1-GFP ha carga transmembrana Mid2-iRFP oñemboja o ERES iñambuévape (Figura 2D). Ko eficiencia clasificación rehegua ojoaju porãiterei análisis bioquímico ojejapo va ekue mboyve (6) ha determinación morfológica (7) ndive. Ikatu avei jahechakuaa mba éichapa ojeporta umi carga cuarentenada oikéva ERES-pe (Ta anga 2E ha Película S2). Figura 2E ohechauka petet pehẽngue michĩmínte Gas1-GFP (panel 3) térã Mid2-iRFP (panel 4) oikeha ERES-pe peteĩ lado guive ha oñemboty peteĩ área discreta-pe. Panel 5 ta anga 2E-pegua ohechauka sapy ánte ojejuhuha Gas1-GFP ha Mid2-iRFP peteĩ ERES-pe, ha katu oike iñambuéva lado guive ha oñeconcentra región separada-pe ikatúva orrepresenta vesícula COPII iñambuéva. Avei romoañete separación ha clasificación ojehecháva GPI-AP Gas1 basado ceramida C26 ERES selectivo ramo ha'e específica ambue carga secreción transmembrana, proteína membrana plasmática etiquetada GFP Axl2 (27 ), ohechaukáva comportamiento ojoajúva Mid2-iRFP. (Ta'anga S1 ha Película S3). Pe Axl2-GFP oñesintetiza pyahúva oñemyasãi membrana ER rupive Mid2-iRFP-icha (Ta anga S1, A ha B), ha oñemohenda co-localizado Mid2-iRFP ndive hetave ERES-pe (Ta anga S1, B guive D peve). Panel 1 ha 2 ta anga 1. S1C ohechauka mokõi techapyrã típico ERES rehegua oñembojoajuhápe mokõi carga transmembrana. Ko ã kásope, mokõive mba e oike oñondive ERES-pe (Ta anga S1E, Panel 3 ha Película S3).
Umi célula sec31-1 oikuaaukáva secreciones inducibles galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) ha Mid2-iRFP (TMP, hovy) ha etiquetado ERES constitutivo Sec13-mCherry (ERES, magenta) oñemoĩ 37-pe Oñeincuba rire 30 minuto °C-pe, oñembohasa 24 °C-pe ojepoi haguã bloque de secreción, ha oñeimahina SCLIM reheve upe rire 20 minuto pukukue. (A guive C peve) Ta anga proyección 2D representativa (A; barra de escala, 1μm) térã ta anga hemisferio celular 3D (B ha C; unidad de escala, 0,456μm) carga rehegua ha 10 z-sección oñemarkáva ERES rupive. Pe panel inferior oĩva (B)-pe ha pe panel oĩva (C)-pe ohechauka taꞌãngamýi oñemboguatáva ohechauka hag̃ua umi mbaꞌerepy oĩva ERES-pe añoite (magenta) [Gas1-GFP (gris) ha Mid2-iRFP (hovy saꞌi)]. (C) Flecha abierto: ERES ogueraha petet carga pehẽngue añoite (1 guive 4 peve). Flecha gris: ERES oguereko carga segregada (5). Flecha sólida morotĩ: ERES oguerekóva carga co-locado. Iguýpe: Pe ERES peteĩva ojeporavóva oguereko Gas1-GFP (1) térã Mid2-iRFP (2) añoite. Barra escala rehegua, 100 nm. (D) Cuantificación fotomicrografía rehegua oñemombe úva (C)-pe. Porcentaje promedio ERES orekóva peteî carga añoite (Gas1-GFP térã Mid2-iRFP), carga segregada ha carga superpuesta. Mbohapy experimento independiente-pe, n=432 54 célula-pe. Barra de error = SD rehegua. Prueba t no pareada mokõi cola rehegua. *** P = 0,0002 rehegua. (E) Ta anga 3D ERES ojeporavóva carga cuarentenada rehegua oguerekóva marca (C). Gas1-GFP (verde) (3) térã Mid2-iRFP (hovy) (4) oike ERES (magenta)-pe peteĩ lado guive ha oñemboty peteĩ área michĩvape ERES ryepýpe. Sapy’ánte, mokõiveichagua carga oike peteĩchagua ERES (5)-pe peteĩ lado guive ha oñemboty peteĩ área aislada-pe ERES ryepýpe. Barra escala rehegua, 100 nm.
Upe rire, roproba peteî hipótesis ceramida cadena acil puku (C26) oîva membrana ER-pe omboguata agrupación ha clasificación específica Gas1 ERES selectivo-pe. Upevarã, roiporu peteĩ cepa levadura modificada GhLag1, upépe oñemyengovia umi mokõi sintasa ceramida endógena Lag1 ha Lac1 GhLag1 (pe homólogo Lag1 algodón rehegua), osẽva peteĩ cepa levadura orekóva peteĩ cepa Ceramida membrana celular mbykyvéva tipo silvestre-gui (Figura 3A) (28). Análisis espectrometría de masas (MS) ohechauka umi cepas de tipo silvestre-pe, 95% ceramida total ha e ceramida cadena ipukuetereíva (C26), ha GhLag1-pe katu 85% ceramida ipukuetereíva (C18 ha C16). ), 2% ceramida añoite ha’e ceramida cadena ipukuetereíva (C26). Jepémo umi ceramida C18 ha C16 ha'e umi ceramida principal ojejuhúva membrana GhLag1-pe ko'ágã peve, análisis MS omoañete avei ancla GPI Gas1-GFP ojehechaukáva cepa GhLag1-pe oreko ceramida C26, oñembojojáva lípido tipo silvestre rehe. Pe calidad ha e petetchaite (Fig. 3A) (26). Upévare, kóva he ise pe enzima remodelación ceramida rehegua Cwh43 ha eha selectivoiterei ceramida C26-pe guarã, ojehechaháicha ta anga 26-pe, omoinge porãve ancla GPI michĩmi ceramida C26-gui cepa GhLag1-pe. S2 (29) rehegua. Upéicharamo jepe, GhLag1 membrana celular básicamente oguereko ceramida C18-C16 añoite, Gas1-GFP katu oguereko gueteri ceramida C26. Ko hecho ojapo ko cepa peteî tembiporu ideal osoluciona haguã específicamente problema cadena acil ipukukue ceramida membrana ER-pe. Pe rol hipotético orekóva clase ha clasificación. Upéi, roestudia raẽ C26 Gas1-GFP ikatuha oñembyaty clúster-pe GhLag1-pe peteĩ alelo mutante sensible temperatura-pe sec31-1 reheve microscopía de fluorescencia convencional rupive, upépe oĩ cadena puku (C18-C16) añoite Ceramida membrana ER-pe (Fig. 3). Rohechakuaa sec31-1-pe, hetave Gas1-GFP oñeconcentra clúster-pe, ha katu Gas1-GFP sec31-1 GhLag1 orekóva membrana ER ceramida ipukúva (C18-C16) ipukúva, principalmente noñembyatýi ha oñemyasãi En la membrana ER pukukue. Ja’e porãsérõ, pe agrupación basada ceramida C26 rehegua ojoaju porãgui ERES específico ndive (Ta’anga 1), upéi roinvestiga ikatúpa ko proceso oike avei pe función mecanismo proteico exportación ER rehegua. GPI-AP oiporu sistema especial COPII exportación ER-pe guarã, ha'éva activamente regulado remodelación estructural Ted1 porción glicano ancla GPI ( 30 , 31 ). Upe rire ojehechakuaa GPI-glicano recombinante complejo receptor carga transmembrana p24 rupive, ha'éva a su vez orekluta selectivamente Lst1, ha'éva peteî isoforma específica subunidad principal de unión carga COPII Sec24, omoheñóiva peteî COPII rico GPI-AP-pe Oñeikotevê vesículas (31-33). Upévare, romopu'ã peteî doble mutante ombojoajúva deleción ko'ã proteína peteîva (componente complejo p24 Emp24, enzima remodelación GPI-glicano Ted1 ha subunidad específica COPII Lst1) cepa mutante sec31-1 ndive, ha roestudia umíva Ikatúpa ojejapo GFP Gas1-cluster (Figura 3). Rohechakuaa sec31-1emp24Δ ha sec31-1ted1Δ-pe, Gas1-GFP principalmente noñembojoajúi ha oñemyasãi membrana ER pukukue, ojehecha haguéicha yma sec31-1 GhLag1-pe, sec31-1lst1Δ-pe katu, Gas1-GFP Sec31-1-icha. Ko'ã resultado ohechauka oîha ceramida C26 membrana ER-pe, agrupación Gas1-GFP oikotevê avei ojoaju complejo p24 rehe, ha noikotevêi reclutamiento específico Lst1. Upéi, rohesa’ỹijo posibilidad pe cadena pukukue ceramida oĩva membrana ER-pe ikatuha omohenda Gas1-GFP jejopy p24 rehe. Ha katu rojuhu oîha ceramida C18-C16 membrana-pe ndoikóiha umi GPI-glicano oñemopu'ã jeýva complejo p24 rupive (Ta'anga S3 ha S4, A ha B) térã ojoaju GPI-AP rehe ha oexporta GPI-AP. ipyrusúva. Ojerecluta subtipo COPII Lst1 (Ta anga S4C). Upévare, agrupación dependiente ceramida C26-gui noikotevẽi interacción proteica iñambuéva mecanismo proteico exportación ER ndive, sino oipytyvõ mecanismo de clasificación alternativo impulsado lípido pukukue. Upéi, roanalisa pe cadena acil ceramida pukukue membrana ER-pe tuicha mba'épa pe clasificación efectiva Gas1-GFP ERES selectivo ramo. Gas1 oĩva cepa GhLag1-pe ceramida cadena mbyky reheve osẽ guive ER-gui ha oike membrana plasmática-pe (Figura S5), roguerovia pe clasificación oñemboguata ramo cadena acil ceramida pukukue rupive, pe Gas1 oĩva cepa GhLag1-pe ikatuha ojeredirigi ha ojehasa. ERES mba’erepy oguerekóva peteĩchagua membrana.
(A) Pe membrana celular GhLag1 rehegua oguereko principalmente ceramidas C18-C16 mbykyvéva, ha katu pe ancla GPI Gas1-GFP rehegua oguereko gueteri pe IPC C26 peteĩchagua umi célula tipo silvestre-icha. Yvate gotyo: análisis cadena acil pukukue rehegua ceramida membrana celular-pe umi cepa de tipo silvestre (Wt) ha GhLag1p espectrometría de masas (MS) rupive. Umi dato ohechauka porcentaje ceramida total. Pe promedio mbohapy experimento independiente rehegua. Barra de error = SD rehegua. Prueba t no pareada mokõi cola rehegua. **** P <0.0001 rehegua. Panel inferior: Análisis MS cadena acil pukukue IPC oîva ancla GPI Gas1-GFP (GPI-IPC)-pe ojehechaukáva umi cepas de tipo silvestre ha GhLag1p-pe. Umi dato ohechauka porcentaje señal IPC total rehegua. Promedio po experimento independiente rehegua. Barra de error = SD rehegua. Prueba t no pareada mokõi cola rehegua. ns, ndaha’éi iñimportánteva. P = 0,9134 rehegua. (B) Oñeincuba 37°C-pe 30 minuto aja umi micrografía fluorescencia rehegua ojejapo hagua microscopía rutinaria de fluorescencia rire 24°C haku. Flecha morotĩ: ER Gas1-GFP clúster. Flecha abierta: Gas1-GFP no agrupado oñemboja o membrana ER pukukue rehe, ohechaukáva tinción anillo nuclear característica ER rehegua. Barra escala rehegua, 5μm. (C) Cuantificación fotomicrografía rehegua oñemombe úva (B)-pe. Pe porcentaje promedio umi célula orekóva estructura puntada Gas1-GFP. Mbohapy experimento independiente-pe, n≥300 célula. Barra de error = SD rehegua. Prueba t no pareada mokõi cola rehegua. **** P <0.0001 rehegua.
Oñesolusiona haguã directamente ko problema, rojapo visualización SCLIM Gas1-GFP ha Mid2-iRFP GhLag1-pe alelo mutante sec31-1 temperatura-sensible (Ta'anga 4 ha Película S4). Ojeguereko rire ER 37°C-pe ha upéi ojepoi 24°C-pe, hetave Gas1-GFP oñesintetiza pyahúva noñembojoajúi ha noñemosarambíri membrana ER pukukue javeve, ojehechaháicha microscopio convencional rupive (Ta anga 4, A ha B). Avei, tuicha porcentaje ERES-pe (67%) oike mokõiichagua carga oñemohendahápe ipype (Ta anga 4D). Umi panel 1 ha 2 ta anga 4C-pegua ohechauka mokõi techapyrã típico ERES rehegua oguerekóva Gas1-GFP ha Mid2-GFP oñembojoajúva. Avei, mokõive mba’erepy oñecontrata peteĩchagua ERES-pe (Ta’anga 4E, panel 3 ha película S4). Upévare, ore resultado ohechauka ipukukue cadena acil ceramida membrana ER-pe ha'eha peteî determinante importante agregación ha clasificación proteína ER.
Umi célula Sec31-1 GhLag1 oikuaaukáva secreciones inducidas galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) ha Mid2-iRFP (TMP, hovy) ha constitutivo ERES-marcado Sec13-mCherry (ERES, magenta) Oñeincuba 37°C-pe. Ojejapo 30 minuto, ojeguejy 24°C peve ojepoi hagua secreciones, ha ojejapo imagen SCLIM rupive 20 minuto rire. (A guive C peve) Ta anga proyección 2D representativa (A; barra de escala, 1μm) térã ta anga hemisferio celular 3D (B ha C; unidad de escala, 0,45μm) umi 10 z-sección oñemarkáva carga ha ERES rupive. Pe panel inferior oĩva (B)-pe ha pe panel oĩva (C)-pe ohechauka taꞌãngamýi oñemboguatáva ohechauka hag̃ua umi mbaꞌerepy oĩva ERES-pe añoite (magenta) [Gas1-GFP (gris) ha Mid2-iRFP (hovy saꞌi)]. (C) Flecha henyhẽva morotĩva: ERES, mba’erepy oñembojehe’a. Flecha abierto: ERES oguereko peteĩ mba’énte. Panel inferior: ERES ojeporavóva oguereko mba’erepy oñembojoajúva (1 ha 2) oñemarkáva (C)-pe. Barra escala rehegua, 100 nm. (D) Cuantificación fotomicrografía rehegua oñemombe úva (C)-pe. Umi unidad sec31-1 ha sec31-1 GhLag1-pe, peteî carga añoite (Gas1-GFP térã Mid2-iRFP) oike, ha porcentaje promedio ERES carga aislada ha carga superpuesta-pe guarã. Mbohapy experimento independiente-pe, n = 432 54 célula-pe (sec31-1) ha n = 430 47 célula-pe (sec31-1 GhLag1). Barra de error = SD rehegua. Prueba t no pareada mokõi cola rehegua. *** P = 0,0002 (sec31-1) ha ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1) rehegua. (E) Ta anga 3D ERES ojeporavóva rehegua oguerekóva carga oñembojoajúva (3) oñemarkáva (C)-pe. Gas1-GFP (verde) ha Mid2-iRFP (hovy) oñemboja ERES (magenta) rehe peteĩ lado guive ha opyta peteĩ área restringida ERES-pe. Barra escala rehegua, 100 nm.
Ko estudio ome'ë evidencia directa in vivo umi carga proteica basada lípido oñemboja'o umi sitio selectivo exportación vía secretora-pe, ha ohechauka importancia orekóva cadena acil ipukukue selectividad clasificación-pe guarã. Oipurúvo peteî técnica microscopía ipoderoso ha de punta hérava SCLIM, rohechauka Gas1-GFP oñesintetiza pyahúva (peteî membrana plasmática tuichavéva GPI-AP orekóva cadena acil ipukuetereíva (C26) porción lípido ceramida) levadura-pe ) Umi región oñembyatýva ER discreto-pe oñembojoaju ERES específico ndive, ha katu umi proteína ojesecretáva transmembrana-gui oñemboja'o membrana ER pukukue (Ta’anga 1). Avei, ko ã mokõiichagua mba e oike ERES iñambuévape selectivamente (Ta anga 2). Pe cadena acil ipukukue pe ceramida celular oíva membranape oñemboguejy C26 guive C18-C16 peve, pe clúster Gas1-GFP oñembyai pe región ER discreta-pe, ha Gas1-GFP oñembohasa jey oheja hagua ER pe proteína transmembrana reheve pe ERES rupive voi (Ta anga 3 ha ta anga 3). 4).
Jepémo GPI-AP oipuru peteĩ mecanismo proteico especializado osẽ haguã ER-gui, rojuhu pe separación dependiente ceramida C26-gui ndojeroviapái umi interacción proteica diferencial rehe ikatúva ogueru especialización ERES-pe (Figuras S4 ha S5). Upéva rangue, ore mba'e ojuhúva oipytyvõ mecanismo de clasificación alternativo omotenondéva agrupación proteica basada lípido ha upéi oñemboyke ambue carga. Ore observación ohechauka región térã clúster Gas1-GFP ojoajúva peteî ERES específico ofalta proteína secretada transmembrana Mid2-iRFP, ohechaukáva clúster GPI-AP dependiente ceramida C26 ombohapéta oike haguã ERES relevante-pe, ha al mismo tiempo, omboyke transmembrana Umi secreción oike ko ERES particular-pe (Figuras 1 ha 2). Ojoavy, oĩramo ceramida C18-C16 membrana ER-pe ndojapói GPI-AP ojapo haguã región térã clúster, upévare nomboykéi térã nomyengoviái umi proteína ojesecretáva transmembrana-gui peteĩchagua ERES-pe (Ta anga 3 ha 4). . Upévare, ropropone ceramida C26 omboguata separación ha clasificación ombohapévo agrupación proteína ojoajúva ERES específico rehe.
Mba éichapa ojehupyty ko agrupación dependiente ceramida C26 rehegua petet área ER específicape. Pe tendencia ceramida membrana rehegua ojesepara hagua lateralmente ikatu ojapo GPI-AP ha ceramida C26 ojapo hagua lípido michtva ha instantáneamente ordenado pe ambiente lípido irregularvévape membrana ER oguerekóva glicerolípido mbykyvéva ha insaturado. Umi clúster calidad rehegua (17, 18). Ko a cúmulo temporal michĩva ikatu oñembojoajuve clúster tuichavéva ha estable-pe oñembojoaju rire complejo p24 rehe ( 34 ). Ojoajúva ko ã mba e ndive, rohechauka C26 Gas1-GFP oikotevẽha oñembojoaju complejo p24 ndive ojapo haguã clúster tuichavéva ojehecháva (Ta anga 3). Pe complejo p24 ha e petet oligómero heterocigómero ojejapóva irundy proteína transmembrana p24 iñambuévagui levadura-pe ( 35 ), ome eva unión multivalente, ikatúva ogueru reticulación umi clúster michĩva GPI-AP rehegua, upéicha rupi oñegenera clúster Estable tuichavéva ( 34 ). Pe interacción oîva umi ectodominio proteico GPI-AP-kuéra apytépe ikatu avei oipytyvõ agregación-pe, ojehechaháicha transporte Golgi aja umi célula epitelial polarizada mamífero-pe ( 36 ). Ha katu, oî jave ceramida C18-C16 membrana ER-pe, complejo p24 ojoaju jave Gas1-GFP rehe, noñeformamo'ãi clúster tuicháva separado. Pe mecanismo subyacente ikatu odepende umi propiedad física ha química específica ceramida cadena acil puku rehegua. Umi estudio biofísico membrana artificial rehegua ohechauka jepémo umi ceramida cadena acil ipukúva (C24) ha mbyky (C18-C16) ikatu ojapo separación de fase, umi ceramida cadena acil ipukúva (C24) añoite ikatu omokyre y Curvatura yvate ha flexión de película omohenda jey hagua pe película. Referencia mutua rupive (17, 37, 38). Ojehechakuaa pe hélice transmembrana TMED2 rehegua, homólogo humano Emp24 rehegua, ointeractúa selectivamente esfingomielina a base ceramida C18 ndive umi lóbulo citoplasmático-pe ( 39 ). Oipurúvo simulaciones dinámica molecular (MD) rehegua, rojuhu mokõive ceramida C18 ha C26 oñembyatyha umi lóbulo citoplasmático jerére hélice transmembrana Emp24 rehegua, ha oguereko hikuái preferencia ojoguáva (Figura S6). Iporã jaikuaa kóva ohechaukaha pe hélice transmembrana Emp24 rehegua ikatuha ogueru distribución asimétrica lípido rehegua membrana-pe. Kóva peteî resultado ndahi'aréi oñemopyendáva células mamíferas rehe. Umi simulación MD ojoguáva ohechauka avei oîha lípido éter (40) . Upévare, ro’espekula pe ceramida C26 oĩva umi mokõi lóbulo ER26-pe ha’eha enriquecido localmente. GPI-AP oíva umi lóbulo luminal-pe ojoaju jave directamente p24 multivalente rehe ha pe acumulación ceramida C26 p24 jerére umi lóbulo citoplasmático-pe, ikatu omotenonde agregación Proteína omoirûva ha curvatura membrana rehegua oñegenera umi dedo rupive (41), upéicha GPI-AP ojesepara región discreta ojoajúva ERES rehe, péva avei ofavorese umi curvada yvate umi región membrana ER rehegua ( 42 ). Umi marandu ojejapo va’ekue ymave oipytyvõ pe mecanismo oñeproponéva ( 43 , 44 ). Pe unión multivalente oligolectinas, patógenos térã anticuerpos umi glicosfingolípido basado ceramida (GSL) rehe membrana plasmática rehe omoñepyrũ agregación GSL tuicháva, omombarete separación de fase ha omoheñói deformación ha internalización membrana rehegua ( 44 ). Iwabuchi etc. (43) Ojejuhu oî jave cadena acil ipukúva (C24) pero ndaha'éiva mbyky (C16), ligando multivalente ojoajúva lactosilceramida GSL rehe omoheñói formación clúster tuicháva ha invaginación membrana, ha transducción señal mediada citoplasma Lyn umi folleto rehe oñeinterdigita cadena acil oñembojoajúva umi neutrófilo rehegua.
Umi célula epitelial polarizada mamífero-pe, concentración red anti-Golgi (TGN) nivel membrana plasmática apical peve ocontrola separación ha clasificación GPI-AP ( 10 , 45 ). Ko agregación oñemotenonde oligomerización GPI-AP rupive ( 36 ), ha katu ikatu avei odepende pe cadena ceramida pukukue jajuhúva levadura-pe. Jepémo GPI-AP mamífero oguereko peteĩ ancla lípido éter rehegua, ha ijestructura química iñambueterei pe ceramida cadena acil ipukuetereívagui, peteĩ estudio nda’aréi ojejapóva ojuhu mokõive lípido oguerekoha evolutivamente ojoguáva propiedad física ha química Ha función ( 40 ). Upévare, pe parte lípido éter rehegua oĩva umi célula mamífero-pe ikatu ojogua pe ceramida C26 oĩva levadura-pe, ha hembiapo haꞌehína oñembojoaju hag̃ua pe ceramida cadena puku rehegua oĩva membrana-pe omokyreꞌe hag̃ua GPI-AP agregación ha clasificación. Jepémo ko posibilidad tekotevê gueteri oñeha'ã directamente, umi mba'e ojejuhúva yma oipytyvõ transporte ceramida cadena acil puku Golgi rete gotyo ndojejapói proteína transferencia citoplasmática, sino odepende síntesis ancla GPI levadura-icha. Upévare, pe mecanismo conservador evolutivo ha eténte ikatuha ombohasa selectivamente ceramida cadena acil ipukuetereíva ha GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) peteĩ vesícula de transporte-pe.
Umi sistema celular epitelial polarizado levadura ha mamífero-pe, GPI-AP agregación ha separación ambue proteína membrana plasmática-gui opavave oiko og̃uahẽ mboyve célula superficie-pe. Paladino ha ambuekuéra. (48) ojuhu TGN células epiteliales polarizadas mamíferas rehe, agrupación GPI-AP ndaha'éi oñeikotevëva clasificación selectiva GPI-APs membrana plasmática apical-pe, sino avei oregula organización agrupación GPI-APs ha Actividad biológica orekóva. Célula superficie rehegua. Levadura-pe, ko estudio ohechauka pe clúster GPI-AP odependéva ceramida C26 ER-pe ikatuha oregula organización clúster ha actividad funcional GPI-AP membrana plasmática rehe ( 24 , 49 ). Ojoajúva ko modelo ndive, umi célula GhLag1 oreko alérgica umi inhibidor GPI térã pohã ohypýiva integridad pared celular ( 28 ), ha tekotevêha umi clúster funcional Gas1-GFP ( 49 ) ceramida punta proyectada apareamiento células levadura ohechauka G Posibles consecuencias fisiológicas células hLag1. GPI-AP jejavy. Ha katu, ñañeha’ãvévo oñeprogramápa pe organización funcional superficie celular rehegua ER guive peteĩ método de clasificación rupive oñemopyendáva lípido pukukue rehe, ha’éta tema ñane investigación oútavape.
Umi cepa Saccharomyces cerevisiae ojeporúva ko tembiapope ojehechauka cuadro S1-pe. Umi cepa MMY1583 ha MMY1635 SCLIM rehegua ojejapo hagua imagen célula viva rehegua ojejapo W303 rapykuéri. Ko'ã cepa oikuaaukáva Sec13-mCherry orekóva etiqueta proteica fluorescente oñemopu'ã ojeporúvo método basado reacción en cadena polimerasa (PCR) orekóva plásmido pFA6a plantilla ramo ( 23 ). Ojejapo kóicha pe cepa oikuaaukáva Mid2-iRFP ojerokyva proteína fluorescente reheve oĩva promotor GAL1 poguýpe. Amplificación PCR secuencia iRFP-KanMx vector pKTiRFP-KAN-gui (regalo E. O'Shea, plásmido Addgene número 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificador recurso de investigación (RRID): Addgene_64687) Ha oñemoinge C-terminal Mid2 endógeno-pe. Oñembotuichave rire secuencia genoma Mid2-iRFP ha oñeclona promotor GAL1-pe, oñeintegra Not I-Sac I tenda plásmido integración pRS306-pe. Pe plásmido pRGS7 osëva oñelinealiza Pst I ndive oñeintegra haguã locus URA3-pe.
Pe gen fusión Gas1-GFP ojehechauka promotor GAL1 poguýpe plásmido centromero (CEN)-pe, ojejapóva kóicha. Pe secuencia Gas1-GFP oñembotuichave PCR rupive plásmido pRS416-GAS1-GFP (24)-gui (don L. Popolo) ha oñeclona pe Xma I–Xho I tenda plásmido CEN pBEVY-GL LEU2 (don C) -pe. Miller; Plásmido addgene papapy 51225; Ñe’ẽ reko ha rekosã’ỹ rehegua: 51225; RRID: Ñembojoapy_51225). Pe plásmido osëva oñembohéra pRGS6. Avei ojehechauka pe gen fusión Axl2-GFP rehegua pe promotor GAL1 vector pBEVY-GL LEU2 rehegua poguýpe, ha iñemopu’ã ha’e kóicha. Pe secuencia Axl2-GFP oñeamplifica plásmido pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23)-gui PCR rupive, ha oñeclona Bam HI-Pst I sitio vector pBEVY-GL LEU2-pe. Pe plásmido osëva oñembohéra pRGS12. Pe secuencia oligonucleótido ojeporúva ko estudio-pe ojehechauka cuadro S2-pe.
Pe cepa oñembojehe a 0,2% adenina ha 2% glucosa [YP-dextrosa (YPD)], 2% rafinosa [YP-rafinosa] rico levadura extracto proteína p (YP) medio (1 % Levadura extracto ha 2% proteína ept). (YPR)] térã 2% galactosa [YP-galactosa (YPG)] fuente de carbono ramo, térã peteĩ medio mínimo sintético-pe (0,15% base de nitrógeno levadura ha 0,5% sulfato de amonio) oñembohetave haguã aminoácido ha base apropiado oñeikotevẽva nutrición-pe guarã , Ha oguerekóva 2% glucosa (medio mínimo glucosa sintética) térã 2% galactosa (medio mínimo galactosa sintético) fuente de carbono ramo.
Imagen tiempo real-pe guarã, umi célula mutante sec31-1 sensible temperatura-pe oikuaaukáva constructo promotor GAL1 guýpe oñemongakuaa medio YPR-pe 24°C-pe peteî pyhare pukukue fase log mbyte peve. Ojejapo rire inducción YPG-pe 24°C-pe 1 aravo aja, oñeincuba umi célula SG-pe 37°C-pe 30 minuto aja, ha upéi oñembohasa 24°C-pe ojepoi hagua bloque de secreción-gui. Ojeporu concanavalina A oñemyatyrõ hagua umi célula petet diapositiva de vidrio rehe ha ojejapo ta anga SCLIM rupive. SCLIM haꞌehína peteĩ microscopio de fluorescencia invertida Olympus IX-71 ha lente aceite de apertura numérica UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), escáner confocal disco giratorio de alta velocidad ha alta relación señal-ruido (Yokogawa Electric), espectrómetro personalizado, ha enfriamiento personalizado Pe sistema intensificador de imagen (Hamamatsu Fotónica) ikatu ome e petet sistema lentes lupa rehegua oguerekóva magnificación paha ×266,7 ha petet cámara dispositivo acoplado carga rehegua ombohetavéva electron (Hamamatsu Photonics) (21). Taꞌãngamýi jegueru ojejapo software personalizado rupive (Yokogawa Electric). Ta anga 3D-pe guará, roipuru petet actuador piezoeléctrico ojejapóva personalizado rovibra hagua lente objetivo verticalmente, ha rombyaty umi parte óptica 100 nm ojuehegui petet pilape. Pe taꞌãnga Z-stack oñembohasa dato voxel 3D-pe, ha pe función teórica punto difusión rehegua ojeporúva microscopio confocal disco giratorio rehegua ojepuru procesamiento desconvolución rehegua software Volocity (PerkinElmer) rupive. Oiporúvo software Volocity oumbra automáticamente análisis de co-locación, oñemedi ERES oimehápe carga. Ojejapo análisis escaneo línea rehegua ojeporúvo software MetaMorph (Dispositivos Moleculares).
Eipuru software GraphPad Prism ojekuaa hagua significación estadística. Pe prueba t Student mokõi cola rehegua ha pe prueba ordinaria análisis de varianza unidireccional (ANOVA)-pe guarã, ojehecha umi diferencia oîva grupo apytépe oguerekoha tuicha impacto P <0,05 (*) rehe.
Microscopía fluorescencia Gas1-GFP rehegua, umi célula fase log rehegua oñemongakuaa peteĩ pyhare pukukue YPD-pe ha oñembyaty centrifugación rupive, ojejohéi mokõi jey salina tamponada fosfato reheve, ha oñeincuba hielo ári por lo menos 15 minuto, ha upéi ojejapo microscopio rupive oje e haguéicha yma Check (24). Ojejogua haguã ojeporu microscopio Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 aceite PH3 CS) orekóva lente objetivo, filtro L5 (GFP), cámara Hamamatsu ha software Application Suite X (LAS X). .
Umi muestra ojedesnaturaliza tampón muestra SDS reheve 65°C-pe 10 minuto aja, ha upéi ojesepara electroforesis gel SDS-poliacrilamida (PAGE) rupive. Análisis inmunoblotting-pe guarã, ojekarga 10 μl muestra por carril. Anticuerpo primario: Ojepuru anti-Gas1 policlonal conejo rehegua dilución 1:3000-pe, anti-Emp24 policlonal conejo rehegua dilución 1:500-pe, ha anti-GFP policlonal conejo rehegua (peteî jopói H. Riezman-gui) dilución 1:3000-pe. Pe anticuerpo monoclonal anti-Pgk1 ratón rehegua ojeporu dilución 1:5000-pe (peteî jopói J. de la Cruz-gui). Anticuerpo secundario: Peroxidasa de rábano (HRP) conjugada kavara anticonejo inmunoglobulina G (IgG) ojeporúva dilución 1:3000 (Pierce). Ojeporu IgG anti-ratón kavara conjugado HRP-pe dilución 1:3000 (Pierce)-pe. Ojehechakuaa zona de respuesta inmune método quimioluminescencia reactivo SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific) rupive.
Oje eháicha (31)-pe, ojejapo petet experimento inmunoprecipitación natural rehegua pe fracción ER enriquecida rehe. Mbykyhápe, ojejohéi umi célula levadura rehegua tampón TNE reheve [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM flúor de fenilmetilsulfonilo ha mezcla inhibidor proteasa rehegua) 600 nm-pe ( OD600) 100 densidad óptica-pe mokõi jey. Oñembyai umi cuenta de vidrio reheve, ha upéi ojeipe a umi célula rembyre ha umi cuenta de vidrio centrifugación rupive. Upéi oñecentrifugákuri pe sobrenadante 17.000 g-pe 15 minuto aja 4°C-pe. Pe pellet oñesuspende jey TNE-pe ha oñembojehe a digitalis saponina peteĩ concentración paha 1% peve. Pe suspensión oñeincuba 1 aravo aja rotación reheve 4°C-pe, ha upéi ojeipe a umi componente insoluble centrifugación rupive 13.000 g 4°C-pe 60 minuto aja. Inmunoprecipitación Gas1-GFP-pe guarã, oñeincuba raẽ pe muestra umi cuenta agarosa vacía reheve (ChromoTek) 4°C-pe 1 aravo aja, ha upéi oñeincuba GFP-Trap_A (ChromoTek) ndive 4°C-pe 3 aravo aja. Umi perla inmunoprecipitado ojejohéi cinco jey TNE oguerekóva digoxigenina 0,2%, ojeelui tampón muestra SDS reheve, ojesepara SDS-PAGE-pe ha oñeanalisa inmunoblotting rupive.
Oje eháicha (31)-pe, ojejapo determinación de reticulación pe fracción ER enriquecida rehe. Mbykyhápe, oñeincuba pe fracción ER enriquecida ditiobis(succinimidil propionato) 0,5 mM reheve (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE.UU.; 20°C, 20 min). Pe reacción reticulación oñembogue oñembojehe ávo glicina (50 mM concentración paha, 5 minuto, 20°C).
Oje e haguéicha yma (50), ojejapo análisis MS ceramida rehegua umi cepas de tipo silvestre ha GhLag1-pe. Mbykyhápe, oñemongakuaa célula fase exponencial peve (3 a 4 unidad OD600/ml) YPD-pe 30°C-pe, ha oñembyaty 25×107 célula. Imetabolismo oñembogue ácido tricloroacético rupive. Ojepuru disolvente extracción rehegua [etanol, y, éter, piridina ha hidróxido de amonio 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] ha 1,2 nmol calidad ceramida C17 estándar interna (860517, lípido polar Avanti) rehegua). Jaipuru reactivo monometilamina rehegua [metanol, y, n-butanol ha solución metilamina rehegua (4:3:1:5 v/v)] jajapo hagua hidrólisis alcalina suave pe extracto rehegua, ha upéi jaipuru n-butanol saturado y reheve jajeheja hagua juky. Ipahápe, oñesuspende jey pe extracto disolvente modo positivo-pe [cloroformo/metanol/y (2:7:1) + acetato de amonio 5 mM] ha oñeinyecta espectrómetro de masas-pe. Ojejapo monitoreo multireacción (MRM) ojekuaa ha oñecuantifika haguã umi molécula esfingolípido. Ko espectrómetro de masas cuadrúpolo terciario TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) oreko fuente robótica iones nanoflujo Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) análisis lípido-pe guarã. Pe energía choque rehegua oñeoptimiza petettet categoría ceramida rehegua. Ojehupyty umi dato MS modo positivo-pe. Káda replicado biológico-pe g̃uarã, pe señal lípida haꞌehína pe mediana mbohapy medición independiente rehegua.
Oje eháicha (31)-pe, umi célula (800×107) oikuaaukáva Gas1-GFP ojejapo inmunoprecipitación natural-pe. Pe Gas1-GFP oñembohykúva ojeipe a SDS-PAGE rupive ha oñembohasa peteĩ membrana flúor de polivinilideno (PVDF)-pe. Pe proteína ojehechauka oñemyatyrõvo PVDF amida morotĩ reheve. Pe banda Gas1-GFP oñeikytĩ PVDF-gui ha ojejohéi 5 jey metanol reheve ha peteĩ jey y grado cromatografía líquida-MS (LC-MS) reheve. Oñeincuba rupi pe tira membrana rehegua 500μl NaOAc 0,3 M (pH 4,0), tampón ha 500μl mezcla nitrito sódico 1 M ojedisuelve pyahúva reheve 37°C-pe 3 aravo aja, ojeipe a pe fracción lípida Gas1-GFP-gui ha ojelisa Liberación de ceramida fosfato inosina rehegua glucosamina ha inositol apytépe (51). Upe rire, ojejohéi irundy jey pe tira de membrana y grado LC-MS reheve, ojejoso temperatura ambiente-pe ha oñeñongatu atmósfera nitrógeno-pe -80°C-pe oñeanalisávo peve. Control ramo ojeporu muestra en blanco membrana PVDF rehegua petet experimentope guara. Upe rire oñeanalisa MS rupive pe lípido ojeipe a va ekue Gas1-GFP-gui oje e haguéicha ( 50 ). Mbykyhápe, umi tira PVDF oguerekóva GPI-lípido oñesuspende jey 75μl disolvente molde negativo-pe [cloroformo/metanol (1:2) + acetato de amonio 5 mM] ha ohasa ionización electrospray (ESI)-MRM/MS Análisis de especies de esfingolípido (TSQ Vantage). Ko kásope ojehupyty umi dato MS rehegua modo ion negativo-pe.
Ja’e haguéicha yma, pe porción lípida ancla GPI rehegua ojeipe’a pe GPI-AP marcado [3H]-inositol-gui ( 16 ). Umi lípido ojeipe a cromatografía capa fina rupive ojeporúvo sistema disolvente (55:45:10 cloroformo-metanol-0,25% KCl) ha ojehechauka ojeporúvo FLA-7000 (Fujifilm).
Umi célula oikuaaukáva Gas1-GFP (600×107) ojejohéi mokõi jey tampón TNE tampón TNE reheve, ha oñembyai vidrio ryru reheve, ha upéi oñecentrifugá ojeipe a hagua célula rembyre ha vidrio ryru. Upéi oñecentrifugákuri pe sobrenadante 17.000 g-pe 1 aravo aja 4°C-pe. Pe pellet ojejohéi TNE-pe ha oñeincuba 1 U PI-PLC (Invitrogen) reheve TNE-pe oguerekóva 0,2% digitalis saponina 1 aravo aja 37°C-pe. Ojejapo rire tratamiento enzima rehegua, ojeipe a pe membrana centrifugación rupive 17.000 g 4°C-pe 1 aravo aja. Oñeinmunoprecipita hagua Gas1-GFP, oñeincuba pe sobrenadante GFP-Trap_A (ChromoTek) ndive 4°C-pe petet pyhare pukukue. Pe Gas1-GFP purificado ojeseparáva SDS-PAGE rupive oñemyatyrõ azul brillante Coomassie reheve. Oñeikytï banda de tinción Gas1-GFP gris ojeréva acueducto rehe, ha upéi alquilación yodoacetamida reheve ha reducción ditiotreitol reheve, ojejapo digestión en gel tripsina reheve. Ojepe’a ha ojeseca péptido tríptico ha péptido GPI-glicano reheve. Pe péptido seco ojejoso 20 μl ýpe. Oñeinyecta petet porción (8μl) LC-pe. Ojeporu petet columna octadecilsilano (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diámetro hyepypegua 150 mm×1,0 mm; Nomura Chemical, Prefectura de Aichi, Japón) ojeipe a hagua umi péptido condición gradiente específico-pe. Pe fase móvil ha e disolvente A (ácido fórmico 0,08%) ha disolvente B (ácido fórmico 0,15% acetonitrilo 80%-pe). Ojeporu sistema Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ojeipe a hagua columna disolvente A reheve 55 minuto aja petet caudal 50 μl min-1 5 minuto aja, ha upéi ojehupi concentración disolvente B rehegua 40% peve. , Tetã peteĩ reko Amérikagua). Pe eluado oñemoinge meme pe fuente de iones ESI-pe, ha oñeanalisa umi péptido tríptico ha péptido orekóva GPI-glicano LTQ Orbitrap XL (espectrómetro de masas híbrido lineal trampa-orbitrap de iones; Thermo Fisher Scientific) rupive. Pe MS ñembosako ipe, oñemboguapy pe tensión fuente capilar rehegua 4,5 kV-pe, ha oñeñongatu temperatura capilar transferencia rehegua 300°C-pe. Pe tensión capilar ha pe tensión lente tubo rehegua oñemohenda 15 V ha 50 V, petettet. Umi dato MS ojehupyty modo ion positivo-pe (resolución 60.000; precisión masa 10 parte por millón) peteî rango de masa 300/m/z relación masa/carga (m/z) 3000. Umi dato MS/MS ojehupyty trampa iones rupive LTQ Orbitrap XL-pe [umi 3 dígito tenondegua odependehápe umi dato, choque omoheñóiva disociación (CID) rehegua].
Ojejapo simulación MD ojeporúvo software GROMACS (52) ha campo de fuerza MARTINI 2 (53-55). Upéi ojeporu pe CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ojejapo hagua petet bicapa oguerekóva dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) ha Cer C18 téra DOPC ha Cer C26. Pe topología ha coordenada Cer C26 rehegua ojegueru DXCE-gui ojeipe ávo umi cuenta extra esfingosina cola-gui. Eipuru proceso oñemombeꞌuva koꞌape embojoja hag̃ua capa doble ha emonguꞌe, upéi eipuru coordenada paha sistema rehegua emopuꞌa hag̃ua peteĩ sistema oguerekóva Emp24. Pe dominio transmembrana levadura Emp24 (residuo 173 a 193) oñemopu'ã α-hélice ramo ojeporúvo tembiporu visual MD (VMD) estructura molecular ( 58 ). Upéi, ojeipe a rire umi lípido oñembojoajúva, oñegranula grueso pe proteína ha oñemoinge bicapa-pe ojeporúvo CHARMM GUI. Pe sistema paha oguereko 1202 DOPC ha 302 Cer C26 térã 1197 DOPC ha 295 Cer C18 ha Emp24. Oñeioniza pe sistema petet concentración 0,150M peve. Ojejapo irundy réplica independiente mokõi composición bicapa-pe guarã.
Pe bicapa lípida ojeequilibra ojeporúvo proceso CHARMM GUI, oikehápe oñemboguejy ha upéi ojeequilibrávo 405.000 paso, upépe oñemboguejy ha oñemboyke mbeguekatúpe umi limitación posición rehegua, ha ojehupi pe paso tiempo rehegua 0,005 ps guive 0,02 ps peve. Ojejapo rire equilibrio, ojapo 6 μs petet paso tiempo rehegua 0,02 ps reheve. Oñemoinge rire Emp24, eipuru peteĩchagua proceso CHARMM GUI emomichĩ ha embojoja hag̃ua sistema, ha upéi eñemboguata 8 s producción-pe.
Opaite sistemape guará, pe proceso de equilibrio aja, pe presión ojecontrola barostato Berendsen rupive (59), ha pe proceso de producción aja, pe presión ojecontrola barostato Parrinello-Rahman rupive (60). Opaite kásope, presión promedio ha e 1 bar ha ojeporu esquema de acoplamiento presión semiisotrópica. Pe proceso de equilibrio ha producciónpe ojepuru petet termostato (61) orekóva recalibración velocidad rehegua oñembojoaju hagua temperatura umi partícula proteína, lípido ha disolvente rehegua petettet. Pe operación pukukue javeve, temperatura meta ha e 310K. Pe interacción no vinculación rehegua oñecalcula ojejapo rupi peteĩ lista de emparejamiento ojeporúvo esquema Verlet orekóva tolerancia búfer 0,005. Pe término Coulomb ojekalkula ojeporúvo campo de reacción ha distancia de corte 1,1 nm. Pe término Vander Waals oipuru petet esquema de corte orekóva distancia de corte 1,1 nm, ha pe esquema de corte Verlet ojepuru deriva potencial rehegua (62).
Oipurúvo VMD, ojekalkula pe longitud de onda de corte umi perla fosfato DOPC térã perla ceramida AM1 ha proteína apytépe ha e 0,7 nm, ha ojekalkula mboy lípidopa ojoaju proteína ndive. Ko fórmula rupive, ñacalcula factor depleción-enriquecimiento (DE) rehegua (63)-peguáicha: factor DE = (pe lípido total oíva proteínape 0,7) proteína 0,7-pe (Cer hetakue lípido totalpe) .
Pe valor oñemombe’úva ojehupyty promedio ramo, ha umi barra de error ha’e irundy copia independiente SE-gui. Pe significación estadística factor DE rehegua ojekalkula prueba t rupive [(promedioDE-factor-1)/SE]. Jakalkula pe valor P pe distribución petet cola reheguagui.
Ojeporu tembipuru GROMACS ojekalkula hagua mapa densidad lateral 2D sistema oguerekóva Emp24 250 ns paha rastro ryepýpe. Ojehupyty hagua mapa de enriquecimiento/depleción ceramida rehegua, oñemboja o pe mapa densidad Cer rehegua suma mapa Cer ha DOPC rehegua rehe, ha upéi oñemboja o concentración Cer rehegua ñande retepýpe. Ojeporu peteĩchagua escala mapa color rehegua.
Umi material suplementario ko artículo-pe g̃uarã, ehecha http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
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Sofía Rodríguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Córtez · Gómez (Alejandro Cortes-Gómez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana María Pérez -Linero), Sergio López (Sergio López), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Proo Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imagen 3D alta resolución tiempo real ohechauka importancia orekóva cadena ceramida ipukukue clasificación proteica umi sitio de salida selectivo-pe.
Sofía Rodríguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Córtez · Gómez (Alejandro Cortes-Gómez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana María Pérez -Linero), Sergio López (Sergio López), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Proo Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
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©2020 Asociación Americana para el Avance de la Ciencia rehegua. opaite derecho ojeguerekóva. AAAS ha’e peteĩ socio HINARI, AGORA, OARE, CORO, CLOCKSS, CrossRef ha CONTADOR. CienciaAvances ISSN 2375-2548 rehegua.