Aguyje reike haguére Nature.com-pe.Pe kundahára versión reiporúva oguereko sa’i pytyvõ CSS-pe g̃uarã.Iporãvévape g̃uarã, romomarandu reipuru hag̃ua peteĩ kundahára oñembopyahúva (térã embogue hag̃ua modo compatibilidad Internet Explorer-pe).Upe aja, roñangareko hag̃ua pytyvõ meme, rohechaukáta pe tenda estilo ha JavaScript’ỹre.
Ndojoguái umi vertebrado-gui, heta oje'e umi mymbachu'i ndoguerekoiha hormona esteroide sexual sesgada kuimba'épe.Anopheles gambiae-pe, ojehecha pe esteroide ecdisona 20-hidroxiecdisona (20E) oevoluciona hague ocontrola haguã óvulo desarrollo oñesintetiza jave kuña2 ha omoheñói haguã periodo refractario de apareamiento oñembohasávo sexualmente kuimba'ekuéra3.Ovulo desarrollo guive ha apareamiento ha'e rasgo reproductivo esencial, oñentende mba'éichapa umi ñati'û kuña Anopheles ointegra ko'ã señal hormonal ikatúva ombohape diseño programa pyahu control de paludismo.Ko'ápe, roikuaauka ko'ã función reproductiva ojeregula distinto esteroides sexuales rupive peteî red compleja de enzimas activadoras/inactivadoras ecdisteroides rupive.Roidentifica peteî ecdisona oxidada específica masculina, 3-dehidro-20E (3D20E), oñangarekóva tuvakuéra rehe ombotývo receptividad sexual kuña oúva transferencia sexual ha activación desfosforilación rupive.Ojehechakuaa, transferencia 3D20E avei omoheñói expresión umi genes reproductivos omantenéva desarrollo óvulo infección Plasmodium jave, oaseguráva salud kuña infectada.20E derivado kuña ndoguerúi sexual respuesta, pero oheja umi tapicha oñeapareáva omoî haguã óvulo ojejoko rire quinasas inhibidora 20E.Ojekuaa ko hormona esteroide insecto específica kuimba'épe ha rol orekóva oregulávo receptividad sexual kuña, fertilidad ha interacción Plasmodium ndive ohechauka potencial omboguejývo éxito reproductivo umi ñati'û ombohasáva paludismo.
Umi káso ha omanóva paludismo rehegua ojupi jey4 oîgui resistencia insecticida ojeipysóva umi ñati'û Anopheles-pe, ha'éva vector único umi parásito paludismo yvypóra rehegua.Pe biología de apareamiento ko'ã ñati'û rehegua ha'e peteî blanco particularmente atractivo umi intervención novedosa control de paludismo-pe guarã péva kuña oñeapareágui peteî jeýnte5; ojapóvo ko evento de apareamiento único estéril orekóta tuicha potencial omboguejývo población mosquito campo-pe.
Kuñanguéra oñeincapacita sexualmente ohupyty rire hormona esteroide título yvate kuimba'égui.Umi estudio ohechauka pe desencadenante hasy haguã oñeapareavévo ha'e 20-hidroxiecdisona (20E), hormona esteroide ojekuaavéva regulador ramo ciclo de mudado etapa larval-pe.La capacidad orekóva kuimba'e osintetiza ha ombohasávo 20E ha evoluciona específicamente en Anopheles especie oikéva subgénero Cellia7-pe, oñemosarambíva África-pe ha oikehápe umi vector ipeligrosovéva paludismo rehegua, umíva apytépe Anopheles gambiae.Péva ojehechakuaa ko'ýte ko'ã especie-pe kuña ojapo avei 20E peteĩteĩ tuguy okaru rire, ha 20E omboguata ciclo oogénesis (ehecha ref. 8).Ha katu sa'i ojekuaa mba'éichapa oñeintegra kuña señales mokôi fuente iñambuéva ecdisona-gui (transferencia masculina ha inducción de alimentación de sangre) ocompromete'ÿre habilidad propia oñeapareávo.Añetehápe, pe 20E omoheñóiva kuña omoheñói ramo intolerancia sexual, péva oguerúta infertilidad umi tapicha okaru vírgen-pe, peteî comportamiento ojehechaitereíva ko'ã ñati'ûme5.
Peteî explicación ikatúva ha'e umi kuimba'e A. gambiae ombohasa peteî ecdisona específica kuimba'e modificada, omombaretéva cascada de señalización kuña tracto reproductivo-pe, oúva inestabilidad de apareamiento.Ha katu, jepémo umi vertebrado oreko múltiple hormona esteroide, ha'eháicha estrógeno ha andrógeno (ojehecha jey ref. 9-pe), ore roikuaaháicha, ndojehechakuaái esteroide androgénico-biased en mymbachu’ikuéra.
Roñemohenda rodetermina haguã repertorio hormona esteroide glándula accesoria kuimba'e (MAG) A. gambiae sexualmente maduro ohekávo posible esteroides modificador.Roiporúvo cromatografía líquida de alto rendimiento ojoajúva espectrometría de masas tándem (HPLC-MS/MS) rangue método menos específico ojeporúva yma, rohechakuaa ecdisona (E) ha 20E ko tejido-pe, omoañetéva yma resultado.Ha katu, pe muestra oguereko dominado umi esteroide fosforilado oxidado, ojoajúva fórmula 3-deshidro-20E-22-fosfato (3D20E22P)12 ndive (Ta anga 1).Ambue forma ha e 3-deshidro-20E (3D20E) ha 20E-22-fosfato (20E22P).La intensidad HPLC-MS/MS de 3D20E22P ha e mokõi órden de magnitud yvateve iforma desfosforilado-gui, 3D20E, ha mbohapy órden de magnitud yvateve pe E ha 20E-gui (Ta anga 1).Jepémo ambue hete ha tracto reproductivo inferior-pe (LRT; Datos Extendidos Fig. 1a).Roanalisa avei ecdys umi kuimba e oñemboty pyahúvape (<1 día de edad) ha kuña ha ojehechakuaa 3D20E ha 3D20E22P MAG-pe añoite; E, 20E ha 20E22P oîkuri mokôive sexo-pe (Datos Extendidos Fig. 1b).Ko a dato ohechauka A. gambiae kuimba e kakuaáva ojapoha título yvate hormona modificante MAG-pe noñesintetizaiva kuña rupive.
MAG ha LRT kuña (oikehápe auricular, vesícula seminal ha parovario) ojedisecciona kuimba'e vírgen orekóva 4 ára (4 ára) ha kuña vírgen ha apareada (0,5, 3 ha 12 hpm).Ecdisona ko'ã tejido-pe oñeanalisa HPLC-MS/MS rupive (media ± sem; prueba de t no emparejado, mokõi lado, mokõi lado, tasa de descubrimiento japu (FDR) oñemyatyrõva, *P < 0,05, **P < 0,01 . 3 aravo vs. 0,5 aravo, P = 0,25;12 aravo vs. 3 aravo, P = 0,0032;12 aravo vs. 0,5 aravo, P = 0,015).Umi dato ha e mbohapy replicado biológico-gui.Ojekalkula ha oñenormalisáva área pico peteîteî ecdisona de interés-pe guarã mboy ñati'û oî.Ecdisona ojehechauka color rupive kóicha: E, verde; 20E, naranja rehegua; 20E22P, morotĩva; 3D20E, hovy; 3D20E22P, rosa.Pe inserto ombohetave escala eje y rehe ohechauka hagua umi nivel ecdisona ijyvatevéva.
Ojekuaa hagua oñembohasápa 3D20E22P ha 3D20E oñeaparea aja, rodisecciona umi LRT kuña opaichagua punto de tiempo oñeaparea rire.Jepémo ndojejuhúi ecdisona vírgen-pe, rohechakuaa cantidad sustancial 3D20E22P LRT-pe oñeaparea riremínte (0,5 h post-apareamiento, hpm), oguejy ohóvo tiempo ohasávape, aja Tuicha ojupi umi nivel 3D20E (Fig. 1).Roipurúvo 3D20E químicamente sintetizado estándar ramo, rodetermina umi nivel ko hormona esteroide rehegua umi LRT de apareamiento-pe ha e por lo menos 100 jey hetave 20E-gui (Tabla de Datos Extendidos 1).Péicha, 3D20E22P ha e pe ecdisona kuimba e tuichavéva oñembohasáva LRT kuñáme oñeapareávo, ha iforma desfosforilada, 3D20E, hetaiterei oñeaparea riremi.Kóva ohechauka peteî rol importante ko'ã última ecdisona-pe guarã biología kuña post-apareamiento-pe.
Ojejapo rire peteî conjunto de datos secuenciación ARN (ARN-seq) pyahu (Fig. 2a), ojeporúvo peteî pipeline bioinformática ojejapóva personalizada, roheka ecdisona quinasa (EcK), ecdisona oxidasa (EO), ha ecdisona ocodigáva gen fosfatasa modificado 20E.EPP) ojehechauka tejidos reproductivos-pe.Roikuaa peteî candidato gen EPP ha mokõi potenciales genes EcK (EcK1 ha EcK2), pero ndikatúi ojuhu peteî gen EO candidato iporãva.Notablemente, umi genes EPP individuales oñeexpresa niveles altos (98,9o percentil) umi MAG gambiano pero ndaha'éi LRTs kuña (Fig. 2b), contrario ore oha'ãrõva desfosforilación 3D20E22P oiko guive ko tejido kuña.Upévare, roguerovia ikatuha oñembohasa EPP kuimba'e apareamiento aja.Añetehápe, roiporu etiquetado isótopo estable in vivo roenmascarávo proteína kuña oñeaparea rire, enzima ohechakuaáva MS auricular kuña-pe (Fig. 2c ha Cuadro Suplementario 1).Oñemoañete avei oîha EPP MAG-pe ha LRT kuña oñeapareáva (pero ndaha'éi vírgen) ojeporúvo anticuerpos específicos (Fig. 2d).
a, Peteí pipeline bioinformática ojejapóva por encargo ojeheka hagua umi tejido reproductivo petet sexo rehegua umi genes ocodigáva EcK, EO ha EPP.Umi papapy oîva flecha ykére ohechauka mboy candidato kuimba e ha kuña peteîteî paso-pe.Ko análisis ohechakuaa peteî gen EPP (EPP) ha peteî gen EcK (EcK1) ojehechaukáva kuimba'épe, ha peteî gen EcK (EcK2) ojehechaukáva mokõive sexo-pe ha katu ndohejáiva peteĩ gen EO candidato.b, Mapa de calor ombojojáva expresión génica candidata umi tejidos vírgen (V) ha apareamiento (M) Anopheles gambiae ha Anopheles albicans-pe.Spca, fecundación; MAGs, glándulas accesorios kuimba’épe; ambue tete pehẽngue, umíva apytépe oĩ umi tete, ipepo, py, hete ikyráva ha umi órgano interno mokõive sexo-pe, ha ovario kuñáme.EcK2 ojehechauka porãiterei mokõive MAG ha auriculares Gambia-pe, ha katu EPP ojejuhu MAG-pe añoite.c, Análisis proteómico de translocación grupo eyaculado kuimba'e auricular-kuérape 3, 12 ha 24 aravo jave, ohechaukáva umi 67 proteína hetavéva.Kuñanguéra oñemongakuaa dieta oguerekóva 15N oetiqueta haguã (ha oenmascarávo) opaite proteína.Kuimba'e noñemarkáiva oñeaparea kuña etiquetada ndive, ha ojedisecciona kuña LRT 3, 12 ha 24 hpm-pe análisis proteómico-pe guarã (ehecha cuadro suplementario 1-pe peteĩ lista completa proteína eyaculatoria rehegua).Inset, EPP, Eck1 ha EcK2 ojehechakuaa MAG kuimba e vírgen-pe análisis proteómico ko a tejido rehegua rupive.d, EPP ojehechakuaa western blot rupive MAG ha LRT kuña apareada-pe, ha katu ndaha éi kuña vírgen térã kuimba e térã kuña rete hembývape.Ojejapo membrana simultáneamente anticuerpos antiactina (control de carga) ha anti-EPP reheve.Opavave kuimba e ha e vírgen.See Figura suplementaria 1 umi dato fuente gel rehegua.Ojejapo mokõi jey Western blot orekóva resultado ojoajúva.
Ojeverifika actividad ecdisteroide fosfofosfatasa EPP rehegua oñeincuba rire HPLC-MS/MS rupive 3D20E22P ojeipe a va ekue MAG-gui (Datos Extendidos Fig. 2a).Avei, romokirirîvo EPP interferencia mediada por ARN (ARNi), rohechakuaa reducción mbarete actividad fosfatasa rehegua umi tejido reproductivo ko ã kuimba e (Fig. 3a), ha kuña rehegua mated with EPP-silenced males showed significant A proporción inferior 3D20E desfosforilado (Fig. 3b) jepénte silenciamiento parcial génico (Datos Extendidos Fig. 2b,c).En contraste, ndorojuhúi cambio significativo relación 20E22P/20E umi ñati'û peteîchaguápe, ikatúva he'i enzima ha'eha específica 3D20E22P (Fig. 3b). 3b).
a, Oguejy actividad fosfatasa MAG-pe ojejapóva silenciamiento EPP rupive ojeporúvo control ARN EPP doble cadena (dsEPP) térã ARN GFP doble cadena (dsGFP).Ojeporu veinte piscina MAG peteîteî replicado-pe (P = 0,0046, prueba t pareada, mokõi lado), ojehechaukáva punto separado.b, Kuña oñeapareáva macho silenciado EPP-pe oguereko a significativamente inferior proporción 3D20E desfosforilado 3 cv-pe (P = 0,0043, prueba t no emparejada, mokõi lado), ha katu umi nivel 20E noñeafectái (P = 0,063, no emparejado). t-test, dos lados).Umi dato oñepresenta media ± sem ramo mbohapy piscina-gui 13, 16 ha 19 kuña peteîteî.c, Kuña oñeapareáva kuimba'e EPP-pe oñemokirirîva ndive oreko tasa significativamente yvateve re-apareamiento (P = 0,0002, prueba exacta Fisher, mokõi lado).Kuñanguéra ojeobliga raê oñeaparea haguã oasegura haguã estado de apareamiento; 2 ára rire, oñecontacta chupekuéra ambue kuimba’e ogueraháva espermatozoide transgénico ndive oevalua haguã tasa de reapareamiento detección cuantitativa PCR rupive pe transgén.d, Kuña oñemongarúva tuguy reheve oñeapareáva kuimba’e oñemokirirĩva EPP ndive tuicha oguejy fertilidad (P < 0,0001; prueba Mann-Whitney, mokõi lado) ha oñemboguejy’imi número de óvulo (P = 0,088, prueba Mann-Whitney, mokõi lado) , ha katu tasa de desove noñeafectái (P = 0,94, prueba exacta Fisher, mokõi lado).Opavave panel-pe, n ohechauka mboy muestra ñati'ũ biológicamente independiente.NS, ndaha'éi significativa.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001 rehegua.
Upe rire, ro’evaluákuri tuicha mba’épa pe desfosforilación ecdisona rehegua omoheñói haguã resistencia apareamiento rehegua kuñáme.Ojekuaa porã, umi kuña oñeapareáva kuimba’e EPP-pe oñemboykéva ndive oñeaparea jey peteĩ frecuencia tuichavévape (44,9%) kuña control-gui (10,4%) oñembohasávo kuimba’e adicional (transgénico) rehe (Fig. 3c).Rohechakuaa avei tuicha oguejyha fertilidad (Fig. 3c). 3d, izquierda) ha oguejy michîmi número de huevo omoîva ko'ã kuña (Fig. 3d, mbytépe), péicha porcentaje de huevo omoîva kuña (ambue respuesta elicitada kuñanguérape apareamiento rupive )) noñeafectái (Fig. 3d, derecha).Oñeme'êvo especificidad ojehecháva EPP 3D20E22P-pe guarã, ko'ã resultado ohechauka activación de 3D20E EPP rupive oñembohasáva oñembojoaju jave ikatu oguereko peteĩ tembiapo iñimportánteva ombogue haguã kuña receptividad oñembojoajuvévo, peteĩ comportamiento ojeatribuíva yma pe transferencia sexual 20E rehe .Upévare, ko hormona específica kuimba'e rehegua oityvyro mbarete avei kuña fertilidad.
Upe rire, rombojoja umi actividad 20E ha 3D20E rehegua umi experimento inyección rehegua umi vírgen sexualmente madura-pe roiporúvo 3D20E sintetizado químicamente (Fig. 4a–c) ha 20E ojeguerekóva comercialmente.Rohechakuaa 3D20E ha’eha significativamente efectivove 20E-gui ombotývo sensibilidad kuña rehegua apareamiento rehegua mokõive concentración-pe (Fig. 4d).Notably, mitad de la nivel fisiológico 3D20E LRT-pe (1.066 pg inyección rire vs. 2.022 pg apareamiento rire) omoheñói peteî proporción kuña refractaria ha'éva 20 jey yvateve nivel fisiológico 20E (361 pg inyección rire) 24 aravo inyección rire concentración ijyvatevéva 18 pg apareamiento rire; Tabla de Datos Extendidos 1).Ko resultado ojoaju noción ndive transferencia sexual 20E ndojapói periodo refractario apareamiento, ha oapuntave 3D20E ha'éva factor tuichavéva oasegura haguã relación tuva ha mitã.3D20E ha'e avei significativamente activo 20E-gui umi ensayo de óvulo kuña vírgen-pe (Fig. 4e), he'íva tasa normal de ovulo ore ojehecháva silenciamiento parcial EPP rire ha'e oîgui actividad residual 3D20E oproducíva gueteri umi factor kuña inducido Apareamiento rupive.
(a,b) 3D20E oñesintetiza químicamente 20E guive (a) conversión/eficiencia yvatetereíva reheve (datos oñepresentáva media ± sem ramo mbohapy reacción síntesis independiente-gui) (b).c, Espectro de masa (mitad inferior) ojoaju exactamente ecdisona ojejuhúva LRT kuña apareada-pe (mita superior).d, Oñembojojávo 20E rehe (0,63 μg, P = 0,02;0,21 μg, P <0,0001;prueba exacta Fisher, mokõi lado) ha 10% etanol (0,63 μg, P <0,0001; 0,21 μg, P <0,0001; prueba exacta Fisher, 2 lado), ha katu 20E tuicha ojupi control-gui dosis yvatevévape añoite (0,63 μg, P = 0,0002; 0,21 μg, P = 0,54; Prueba exacta Fisher, 2 lado).e, inyección 3D20E omoheñói tasa de desove significativamente yvateve kuña vírgen-pe umi control etanol 10%-gui (0,21 μg, P < 0,0001; 0,13 μg, P = 0,0003;prueba exacta Fisher, mokõi lado), ha katu 20E oñembojojávo control-kuéra rehe Dosis yvatevévape añoite (0,21 μg, P = 0,022; 0,13 μg, P = 0,0823; prueba exacta Fisher, mokõi lado).3D20E omoheñói tasa de desove significativamente yvateve 20E-gui dosis yvateve (0,21 μg, P = 0,0019; 0,13 μg, P = 0,075; prueba exacta Fisher, mokõi lado).Opavave panel-pe, n ohechauka mboy muestra ñati'ũ biológicamente independiente.NS, ndaha'éi significativo.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0.001.Dato ha’e mbohapy replicado-gui.
Umi estudio ohasava'ekuépe, rodetermina transferencia sexual hormona esteroide oinduce expresión MISO (Estimulador Inducido por Apareamiento de Oogenesis 11), gen reproductivo kuña oñangarekóva A. gambiae kuñanguéra infección P. falciparum-gui Umi costo salud omoheñóiva 13, parásito paludismo humano oporojukáva.Oñeme'ëvo importancia orekóva MISO aptitud reproductiva Anofeles-pe umi área endémica paludismo-pe, rodesidi rodetermina mba'e hormona 3D20E térã 20E ombohapéva expresión ko gen.Rojuhu inyección 20E específicamente térã ipoderosovéva oinduce algunos receptores hormonales nucleares (HR), ha'eháicha HR3 ha HR4, ha típico blanco esteroide aguas abajo, ha'eháicha umi genes yolcogénicos Vg14, 15, 16, MISO ha'e hetave mbarete oñemboguata 3D20E rupive (Datos Extendidos Fig. 3).Péicha, pe transferencia sexual ko hormona esteroide androgénica rehegua ojekuaa omoheñóiha mecanismo oñangarekóva kuñanguéra rehe umi costo omoheñóiva infección parásita.Avei, 3D20E ohypýi diferencialmente mokõive isoforma receptor E EcR, omoheñóiva EcR-A ha represión EcR-B, ha imbaretevéva ombohapéva ambue genes omoheñóiva apareamiento, oimehápe HPX15, ohypýiva kuña fertilidad.Kóva ikatu omyesakã infertilidad significativa ojehecháva kuña oñeapareáva kuimba'e EPP-pe oñemokirirĩva ndive (Datos Extendidos Fig. 3).Ko'ã dato ohechauka oîha vía aguas abajo preferentemente activada mokõi hormona ecdisona ikatúva oñemopyenda función sexo específica.
Upe rire, roproba mba'éichapa omba'apo umi mokõi genes EcK ojehechakuaáva ore pipeline bioinformática-pe.Oñemokirirîvo EcK1 térã EcK2 oreko resultado tuicha mortalidad kuimba'épe (Datos Extendidos Fig. 4a), ohechaukáva fosforilación ecdisona, ha upéicha inactivación, tuicha mba'e sobrevivencia-pe guarã.Pórke EcK2 ojehechauka niveles superiores EcK1-gui ha ojehechakuaa MAGs-pe por proteómica (Fig. 2b,c ha Cuadro Suplementario 2), rovalida iactividad ecdisteroide quinasa roincubávo 20E ndive, upévagui osẽ fosforilación 20E22P (Datos Extendidos Figura 2).4b).Ojeporúvo 3D20E sustrato ramo, ndaikatúi rohechakuaa producto fosforilado 3D20E22P (Datos Extendidos Fig. 4c), ohechaukáva 20E ndaha'éi 3D20E ikatu ha'e pe blanco ojeiporavóva EcK2-pe.
Según ore análisis ARN-seq, EcK2 ojehechauka tuicha avei LRT kuña vírgen-pe, upépe oñembogue oñeaparea rire (Fig. 2b).Romoañete ko'ã dato ha rodetermina expresión EcK2 noñeafectái tuguy ñemongaru (Datos Extendidos Fig. 5a).Rombotuichave ore experimento MS ñepyrũrã, rodetermina pico 20E22P ojoaju estrechamente pico ndive de 20E (22-26 aravo ojekaru rire tuguy; Datos Extendidos Fig. 5b).Oñemokirirîvo EcK2 kuña vírgen-pe oreko resultado ojupívo 3 jey relación relativa 20E ha 20E22P 26 h okaru rire tuguy (Datos Extendidos Figuras 2c ha 5c), omoañetéva EcK2 avei ofosforila 20E en kuña.Ojekuaa porã, umi vírgen EcK2-depletada omantene receptividad sexual plena (Datos Extendidos Fig. 5d,e), he'ívave producción kuña 20E ndoinducei periodo refractario apareamiento.Ha katu, ko'ã kuña oguereko tuicha ojupíva tasa de poneción de óvulo oñembojojávo control rehe, hetave 30% vírgen ome'êva óvulo (Datos Extendidos Fig. Fig. 5f).Ojejapóramo inyección ARN Eck2 doble cadena (dsEcK2) oñemongaru rire tuguy, ndoikói desove, ko'ã momento-pe oguejy kuri pico 20E oje'úgui tuguy.En general, ko'ã resultado oipytyvõ modelo 20E omoheñóiva tuguy chupa rire ikatúva omoheñói desove, pero ojere jave añoite bloque de desove (EcK2 ha ikatu ambue factor). off by mating.Ni umi inyección 20E ni 3D20E ndojokói expresión EcK2 vírgen-kuérape (Datos Extendidos Fig. 5g), he'íva ambue factor omediaha inhibición ko quinasa.Ha katu, umi nivel 20E oñemongaru rire tuguy ndaha'éi suficiente omoheñói haguã incomodidad apareamiento, pero efectivamente odispara niveles altos 3D20E oñembohasáva sexualmente.
Ore resultado ome'ë perspectiva importante umi mecanismo oreguláva éxito reproductivo A. gambiae.Osẽ peteî modelo oimehápe kuimba'e oevolucionáva osintetiza haguã título yvate 3D20E, ecdisona modificada específica kuimba'épe oaseguráva tuvakuéra desensibilizando kuñanguérape oñeapareavévo.Upe jave avei, ko'ã vector paludismo oevoluciona avei sistema eficiente oactiva haguã 3D20E kuñáme ombohováivo transferencia sexual EPP específico kuimba'épe.Ore roikuaaháicha, kóva ha'e peteîha techapyrã sistema hormonal esteroide dominado kuimba'e ha kuña ojapóva función única ha crítica umi insecto-pe.Oñepostula función ecdisona específica kuimba'épe pero ndojehechái definitivamente.Techapyrã, hipótesis tuicha oñemboykéva 18 ha'e ko'ã función ikatu ojejapo pe 20E precursor E1.Ojekuaa porã Drosophila-pe, monandría oñemboguata transferencia sexual rupive umi péptido sexual michîva19,20 ointeractuáva neuronas ndive oinerva tracto reproductivo kuña rehegua receptor específico péptido sexual rupive21,22.Oñeikotevêve tembiapo ojekuaa haguã umi cascada señalización aguas abajo controlada 3D20E rupive umi kuña A. gambia-pe ha ojekuaa haguã ikatúpa oñeñongatu ko’ã cascada ñati’ũ ha Drosophila apytépe.
Oñeme'ëvo rol importante 3D20E fertilidad ha comportamiento kuñanguéra ojehechakuaáva ore estudio-pe, umi tape ogueraháva síntesis ha activación 3D20E oikuave'ë oportunidad pyahu estrategias de control de mosquitos futuras, ha'eháicha generación de machos estériles competitivos estrategias tecnología insecto estéril-pe Ojeporu liberación silvestre térã oimitávo 3D20E en juego vírgen.The función específica kuimba'e rehegua 3D20E ikatu oevoluciona A. gambiae ha ambue especie Cellia ohupyty jave capacidad ocoagula haguã isemen tapón de apareamiento-pe, péva opermitígui transferencia eficiente hetaiterei hormona ha enzima activadora hormonal.A su vez, evolución 3D20E omoañetéva monandría ome'ë mecanismo kuñanguérape guarã (alta expresión MISO rupive) ofavorese haguã chupekuéra aptitud reproductiva umi área oîhápe heta prevalencia paludismo, oipytyvõva indirectamente Plasmodio ñembohasa.Ojehecha kuña 20E oguerekoha efecto pypuku P. falciparum rekove ha okakuaa haguã ñati'û Anopheles kuña-pe,24 mokõive tape hormona esteroide kuimba'e ha kuña ha'e ko'ágã aspecto clave interacción mosquito-parásito.
A. gambiae cepas G3 oñemongakuaa condición insecto estándar-pe (26-28 °C, humedad relativa 65-80%, fotoperiodo 12:12 h tesape/pytũmby).Oñemongaru larva-kuérape pira rembi'u en polvo reheve (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets ha Tetra Pond Sticks peteî relación 7:7:2).Kakuaa ñati'ûkuérape oñemongaru ad libitum solución dextrosa 10% ha yvypóra ruguy semanal (componentes de estudio).Ojehupyty ñati'û vírgen ojesegregávo sexo etapa pupal-pe ojehecha rire microscopía rupive ijyke.Oje'e kuri yma kuimba'e ogueraháva transgén DsRed.
Ojejapo experimento de apareamiento forzado umi protocolo oñemombe u va ekue yma.Apareamiento naturalpe guara, kuña vírgen orekóva 4 ára oñeñongatu peteĩ relación 1:3 kuimba e vírgen sexualmente maduro ndive mokõi pyhare pukukue.Umi experimento oñeinyectahápe kuimba ekuérape dsEPP, co-caging ojoaju ára 3-4 inyección rire, oñembokirirĩ jave máximamente actividad fosfatasa rehegua (Extended Datos Fig. 2b rehegua).
Ojejapo disección umi tejido ñati'ũ rehegua, umi retekue hembýva (hete rembyre), térã hete tuichakue 100% metanol-pe ha oñehomogeneisa peteĩ perlas reheve (2 mm perlas de vidrio, 2.400 rpm, 90 seg).Umi cantidad tejido ha volúmen metanol rehegua ha'e ko'ãva: hete rembyre, 50 en 1.000 μl; MAG, 50–100 80 μl rehegua; kuña LRT, 25–50 80 μl.Ojejapo pe precipitado mokõiha extracción metanol rehegua peteĩchagua volumen metanol reheve.Ojepe a centrifugación rupive umi escombro celular rehegua.Oñembojoaju ha ojejoso pe metanol mokõive extraccióngui oúva flujo de nitrógeno guýpe, upéi oñesuspende jey ko a volúmen metanol 80% ýpe: hete rembyre, 50 μl rehegua; MAG ha LRT kuña rehegua, 30 μl.
Oñeanalisa umi muestra espectrómetro de masas (ID-X, Thermo Fisher) oñembojoajúva instrumento LC (Vanquish, Thermo Fisher) rehe.Oñeinyecta 5 μl muestra petet columna 3 μm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) rehe oñemantenéva 25 °C-pe.Umi fase móvil LC-pe guará ha e A (y, 0,1%). ácido fórmico) ha B (acetonitrilo, ácido fórmico 0,1%).Pe gradiente LC rehegua ha e kóicha: 5% B 1 minuto aja, upéi ojupi 100% B peve 11 minuto aja.8 minuto rire 100%, ojeequilibra jey pe columna 5% B-pe 4 minuto aja.Pe caudal ha e 0,3 ml min-1.Ionización fuente MS-pe ha e ojehupytýva ionización electrospray hakuáva rupive umi modo positivo ha negativo-pe.
Pe espectrómetro de masas omedi umi dato oîva rango m/z 350 guive 680 peve resolución 60.000-pe modo MS completo-pe.Ojehupyty dato MS/MS [M + H]+ (opavave blanco), [M - H2O + H]+ (opavave blanco), ha [M - H]- (opaite blanco), ha [M - H]- (opaite blanco) rehe.Ojeporu dato MS/MS omoañete haguã propiedad ecdisona umi blanco-pe guarã ndorekóiva estándar ojeguereko.Ojekuaa hagua ecdisteroides no dirigido, oñeanalisa umi dato MS/MS opavave pico HPLC orekóva >15% abundancia relativa.Ocuantifika ojeporúvo curva estándar ojejapóva estándar puro-gui (20E, 3D20E) ojekalkula haguã cantidad absoluta térã diluciones peteî muestra específica (opavave ambue blanco) ojekalkula haguã equivalencia orekóva umi cantidad ojejuhúva peteî kuimba'épe.Por 3D20E, ojejapo cuantificación ojeporúvo suma ko'ã aducto: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Ojepe'a ha oñecuantifika dato ojeporúvo Tracefinder (versión 4.1).Oñeanalisa umi dato MS/MS ojeporúvo Xcalibur (versión 4.4).Umi espectro MS E, 20E ha 3D20E oñembojoja umi estándar respectivo rehe.3D20E22P oñeanalisa derivatización rupive reactivo Girard reheve.20E22P oñeanalisa relación m/z rupive.
Ojepurifika 3D20E22P MAG-gui.Ojejapo purificación escala analítica-pe ojeporúvo cromatógrafo líquido ultra-rendimiento (Acquity, Waters) orekóva detector basado en masa cuadrúpolo (QDa, Acquity, Waters) umi condición LC ojoajúva análisis HPLC-MS/MS-pe.Oñemboguata colección de fracciones okorrespondévo m/z okorrespondéva 3D20E22P ojehechakuaa pe tiempo de retención ojedetermina haguéicha yma.Upe rire ojehecha mba éichapa ipotĩ umi compuesto ojeipe a va ekue HPLC-MS/MS rupive oje e haguéicha yvateve.
Ojepe a ARN total 10-12 tejido reproductivo téra ambue parte tete rehegua (akã’ỹva) ojeporúvo reactivo TRI (Thermo Fisher) ojejapoháicha fabricante he’iháicha.ARN oñeñangareko ADNsa TURBO (Thermo Fisher) reheve.Oñesintetiza ADNc ojeporúvo transcriptasa inversa virus leucemia murino Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) ojejapo rire fabricante instrucciones.Umi cebador PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR; Cuadro de Datos Extendidos 2)-pe guarã oñemoherakuãma kuri24 térã ojejapo ojeporúvo Primer-BLAST26, oñeme'ẽ preferencia umi producto orekóva 70-150 bp tamaño ha oñemopyendáva junciones exón-exón térã cebadores par Primer osepara exones.cDNA muestra mbohapy a irundy réplica biológica ojedilui irundy jey ýpe RT-qPCR-pe guarã.Ojejapo cuantificación 15 μl reacciones replicadas orekóva 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), cebadores, ha 5 μl ADNc diluido.Ojejapo reacciones sistema PCR tiempo real QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) ha oñembyaty ha oñeanalisa dato ojeporúvo Diseño ha Análisis (versión 2.4.3).Ojehechaukaháicha ko estudio-pe, oñenormalisáva cantidad relativa gen ribosómico RpL19 (AGAP004422), expresión noñemoambuéi tuicha tuguy oñemongaru jave 27 térã apareamiento 3 .
Ojehechakuaa ARN calidad ojeporúvo Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent).Oñembosako i ha oñemboguata biblioteca ilumina paread-end Broad Institute of MIT ha Harvard-pe.Oñemohenda secuenciación lectura genoma A. gambiae (cepa PEST, versión 4.12) ojeporúvo HISAT2 (versión 2.0.5) orekóva parámetro por defecto.Reads con calidad de mapeo (MAPQ) puntuación <30 ojeipe a ojeporúvo Samtools (versión 1.3.1).Ojeipapa mboy lectura oñemomapeáva umi genes-pe ojeporúvo htseq-count (versión 0.9.1) orekóva parámetro por defecto.Ojekalkula conteo lectura normalizado ha oñeanalisa expresión génica diferencial ojeporúvo paquete DESeq2 (versión 1.28.1) R-pe (versión 4.0.3).
Ojekuaa umi candidato gen omoambuéva ecdisona ojeheka raẽvo genoma A. gambiae ojeporúvo algoritmo PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), ojeporúvo valor por defecto Parámetro orekóva ko'ã secuencia proteica consulta: Bombyx mori-gui (Accesión No. NP_001038956,1), Musca domestica (Accesión No XP_005182020.1, XP_005175332,1 ha XP_011294434,1) ha demolitor Microplitis (Accesión No XP_008552646,1 ha XP_008552645,1) ha’e peteĩ mba’e ojehúva. EcK oúva B. mori (Accesión No NP_001036900), Drosophila melanogaster (Accesión No NP_651202), Apis mellifera (Accesión No XP_394838) ha Acyrthosiphon pisum (Accesión No XP_001947166); ha EPP B. mori-gui (Accesión No XP_001947166) NP_001177919.1 ha NP_001243996.1) ha EO D. melanogaster-gui (Accesión No NP_572986.1) (paso 1).Upéi, ojegolpea filtro oñemopyendáva expresión ARNm yvate (>100 fragmentos/exones kilobasas por millón de lecturas mapeadas (FPKM) térã >85%) tejido reproductivo-pe (LRT térã MAG kuña) Gambia-pe (paso 2). Oñemoporãve haguã especificidad, roiporavo enzima candidata ojehechaukáva avei tejido reproductivo A. albimanus-pe, peteî especie anopheles nosintetiza ni nombohasáiva ecdisona apareamiento jave.Ojefiltra umi genes candidatos oñemopyendáva expresión baja (<100 FPKM térã <85o percentil) tejido reproductivo A. albimanus-pe (paso 3).As peteî filtro paha (paso 4), umi gene candidato oikotevẽ osatisface por lo menos peteĩva ko’ãvagui: (1) significativamente up-regulado oñeapareamiento rire (P < 0,05) según análisis de genes expresados ​​diferencialmente ha (2) umi tejido no reproductivo-pe (< 85 % térã <100 FPKM).
Romoambue umi método oñemombe u va ekue ymave 28,29,30 ojehupyty hagua etiquetado isotópico organismo entero rehegua.Mbykyhápe, oñeha a Saccharomyces cerevisiae tipo II (YSC2, Sigma) tipo silvestre base nitrógeno levadura rehegua (BD Difco, DF0335) oguerekóva (peso/vol) glucosa 2% (G7528, Sigma), 1,7%, 1,7%. ndoguerekóiva aminoácido ha sulfato de amonio. medio de cultivo) ha 5% sulfato de amonio 15N (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) fuente única ramo nitrógeno rehegua.Ojerecupera levadura centrifugación rupive ha oñemongaru ad libitum larva ñati’ũ rehegua pupación peve.Suplemento harina de pescado reheve (0,5 mg por 300 larva) ojehapejoko haguã irundyha instar mortalidad.Upéi ojeporu kuña añoite experimento de apareamiento-pe kuimba'e noñemarkáiva ndive oñeanalisa haguã proteoma kuimba'e oñembohasáva apareamiento jave.
Umi kuña vírgen etiquetada 15N orekóva 4-6 ára ojeobliga oñeaparea haguã kuimba'e vírgen no etiquetado edad ojoajúva ndive.Ojeverifika apareamiento exitoso ojehechakuaávo tapón de apareamiento microscopía epifluorescencia rupive.3, 12 ha 24 hpm-pe, ojedisecciona umi auricular 45-55 kuña apareada 50 μl amonio-pe tampón bicarbonato (pH 7,8) ha homogeneisa mazo rupive.Oñecentrifugá pe homogenado ha oñembojehe a pe sobrenadante 50 μl RapiGest 0,1% (186001860, Waters) ndive bicarbonato de amonio 50 mM-pe.Pe sobrenadante ha pellet oúva petet muestragui oñecongela pya e hielo seco ári ha oñemondo petet pyhare pukukue pe Laboratorio MacCoss Universidad de Washington-pe, oñemohu'ãhápe muestra ñembosako'i LC-MS/MS-pe guarã.Oñesuspende jey pellet 50 μl 0,1% RapiGest-pe bicarbonato de amonio 50 mM-pe ha oñesonica baño de agua-pe.Ojemedi concentración proteica pellet ha sobrenadante ensayo BCA rupive, oñemboguejy muestra 5 mM dithiothreitol reheve (DTT; Sigma), ojealquila yodoacetamida 15 mM (Sigma) reheve ha oñeincuba 37 °C-pe (1:0 50) 1 aravo aja tripsinización reheve: relación tripsina:sustrato reheve).Oñembojehe a RapiGest oñembojehe a rupi HCl 200 mM, upéi oñeincuba 37 °C-pe 45 minuto aja ha oñecentrifuga 14.000 rpm 10 minuto aja 4 °C-pe ojeipe a hagua umi escombro.Ojejohéi muestra extracción de fase sólida doble modo rupive (cartuchos Oasis MCX, Waters) ha oñesuspende jey ácido fórmico 0,1%-pe petet concentración proteica paha 0,33 μg μl-1.Oñeanalisa ojoguaite umi proteoma MAG no etiquetado vírgengui males.Oñeanalisa mokôi réplica analítica peteîteî muestra rehegua.Upéi oñeanalisa 1 μg peteîteîgui ojeporúvo columna de sílice fusionada 75 μm 25 cm orekóva trampa frit de sílice fusionada Kasil1 (PQ) 4 cm embalado resina de fase inversa Jupiter C12 (Phenomenex) ha cromatografía líquida 180 minutos. Digestión muestra rehegua – MS/MS ojejapo espectrómetro de masas Q-Exactive HF (Thermo Fisher) reheve peteĩ Sistema UPLC nanoACQUITY (Waters) reheve.Oñemoambue dato adquisición rehegua ojejapóva peteĩteĩva jeguatarã formato mzML-pe ojeporúvo Proteowizard (versión 3.0.20287) ha ojeporúvo Comet31 (versión 3.2) base de datos FASTA oguerekóva proteína rehe secuencias de Anopheles gambiae (VectorBase versión 54), Anopheles coluzzi Ojejapo peteĩ jeheka Mali-NIH (VectorBase versión 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, marzo 2021), A. gambiae ARN-seq, ha mbohapy marco ñembohasa umi contaminante yvypóra ojekuaáva rehegua.Ojekuaa ojeporúvo FDR mapa-peptido-pe oñembojoajúva Percolador32 (versión 3.05) orekóva umbral 0,01, ha oñembyaty umi péptido identificación proteica-pe ojeporúvo parsimonia proteica Limelight33-pe (versión 2.2.0).Ojeestima abundancia proteica relativa ojeporúvo factor de abundancia espectral normalizada (NSAF) oñecalculava'ekue peteîteî proteína peteîteî carrera-pe oñemombe'u haguéicha yma.NSAF relativo peteîteî proteína ojepromedio muestra mokõi biológica iñambuévagui replicate.15N etiquetado oenmascará porã proteoma kuña, jepénte ikatu ojehechakuaa michĩmi proteína no etiquetada umi vírgen etiquetada-gui.Roregistra detección reducción proteína masculina (1-5 espectro) muestra cruda kuñáme carrera técnica-pe añoite, ko'ápe muestra cruda ojejapo muestra kuimba'e/apareamiento rire, péva resultado HPLC “carry over”.Sapy'a py'a proteína ojejuhúva ha'eháicha ‘contaminantes’ oúva vírgen etiquetada-gui oñemoĩ cuadro Suplementario 1-pe.
Mokõi péptido antigénico, QTTDRVAPAPDQQQ (isotipo PA ryepýpe) ha MESDGTTPSGDSEQ (isotipo PA ha PB ryepýpe) Genscript-pe.Oñembojoaju umi mokõi péptido, upéi oñembojoaju proteína portadora KLH rehe ha oñeinyecta conejo Nueva Zelanda-pe.Ojesakrifika umi conejo irundyha inyección rire, ha ojeipe a IgG total afinidad rupive purificación.Ojeporu IgG conejo específicovéva EPP-gui ojejapove haguã western blotting.
Umi western blot-pe guarã, MAG (n = 10, upépe n ohechauka mboy muestra ñati’ũ biológicamente independiente) ha kuña LRT (n = 30) kuimba’e vírgen 4 ára ha kuña vírgen térã apareamiento forzado-gui (<10 apareamiento rire), tampón extracción proteica (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% NP-40; 0,25% NP-40; 0,25%). Oñembojehe a por separado desoxicolato 150 mM; °C.Oñecuantifika proteína ensayo Bradford rupive (Bio-Rad).Upéi, ojedesnaturaliza 20 μg proteína MAG, 40 μg proteína LRT ha 20 μg proteína a granel residual ha ojesepara 10% Bis-Tris NuPAGE rupive ojeporúvo tampón MOPS.Oñembohasa proteína membrana fluoruro de polivinilideno-pe ojeporúvo transferencia iBlot2 sistema (Thermo Fisher).Ojejohéi mokõi jey membrana 1× PBS-T-pe (0,1% Tween-20 PBS-pe) ha upéi oñemboty tampón bloqueante Odyssey (Li-Cor)-pe 1 aravo pukukue 22°C-pe.Oñemboveve membrana peteĩ pyhare pukukue 4 °C-pe anticuerpo primario policlonal anti-EPP conejo personalizado (1:700 tampón bloqueante-pe) ha conejo reheve anticuerpo primario monoclonal antiactina MAC237 (Abeam; 1:4.000).Ojejohéi membrana PBS-T reheve ha upéi oñeincuba anticuerpos secundario reheve (anticuerpo burro 800CW ha anti-rata kavara 680LT (Li-Cor), mokõivéva 1:20.000) tampón bloqueo oguerekóva 0,01% SDS ha 0,2% reheve. Tween -20 1 aravo aja 22 °C-pe.Ojejohéi membrana PBS-T rupive ha ojejapo ta anga escáner Odyssey CLx rupive.Oñembyaty ha oñemboguata ta anga Image Studio-pe (versión 5.2).Ndojejuhúi banda específica okorrespondéva isoforma EPP-RA (82 kDa).
Umi región codificadora EPP rehegua (isoforma AGAP002463-RB ramo oguerekóva dominio histidina fosfatasa, NCBI dominio ojeporeka 34) ha EcK2 (AGAP002181) oñeclona plásmido pET-21a(+)-pe (Novagen Millipore Sigma) ; umi cebador oñemoĩ Datos Extendidos-pe Cuadro 2.Oñemoinge ocho enlazador GS4 (en tándem) pe etiqueta 6xHis C-terminal mboyve pe constructo pET-21a(+)-EcK2 rehegua.Ojejapo proteína recombinante ojeporúvo reacción de síntesis proteica E. coli libre de células NEBExpress (New England BioLabs).Oñepurifika proteína recombinante ojeporúvo columnas de espinas Ni NEBExpress (New England BioLabs).Ojejapo proteína control dihidrofolato reductasa (DHFR) ojeporúvo plantilla ADN NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit-gui.Oñongatu proteína 50% glicerol-pe PBS-pe -20 °C-pe 3 jasy peve.
Ojemedi actividad fosfatasa EPP ha umi extracto tejido rehegua ojeporúvo 4-nitrofenil fosfato (pNPP; Sigma-Aldrich).Pe tampón de reacción oguereko 25 mM Tris, ácido acético 50 mM, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, ha 1 mM DTT.Ojehomogeneisa tejido tampón de reacción-pe ha ojeipe a célula rembyre centrifugación rupive.Oñepyrü reacción oñembojehe ávo enzima téra extracto tejido rehegua tampón de reacción oguerekóva 2,5 mg ml-1 pNPP.Oñeincuba pe mezcla de reacción temperatura ambiente-pe pytũmbýpe, ha oñecuantifika pe pNP oñekonvertíva pNPP-gui oñemedi rupi absorbancia 405 nm-pe opaichagua jave.
Actividad EcK in vitro-pe guarã, oñeincuba proteína 0,2 mg 20E térã 3D20E ndive tampón 200 μl (pH 7,5)-pe oguerekóva 10 mM HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP ha 10 mM MgCl2 2 h aja 27 °C-pe.Ojejoko pe reacción oñembojehe ávo 800 μl metanol, upéi oñembopiro y -20 °C-pe 1 aravo aja, upéi oñecentrifugá 20.000 g-pe 10 minuto aja 4 °C-pe.Upéi oñeanalisa pe sobrenadante HPLC-MS/MS rupive.Oñeinactiva haku hagua umi proteína ojeporúva grupo control-pe, oñeincuba umi proteína 50% glicerol-pe PBS-pe 20 min 95°C-pe.
Actividad EPP in vitro-pe guarã, oñeincuba proteína 3D20E22P (ojoja pe ojejuhúva 18 pares MAG-pe, oñembopotyva’ekue HPLC-MS/MS rupive) tampón 100 μl-pe (pH 7,5) oguerekóva 25 mM Tris, ácido acético 50 mM, Bis-Tris 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM, ha DTT 1 mM 3 aravo aja 27 °C-pe.Ojejoko pe reacción oñembojehe ávo 400 μl metanol ha oñembopiro y -20 °C-pe 1 aravo aja, upéi oñecentrifugá 20.000 g-pe 10 minuto aja 4 °C-pe.Ojeanalisa pe sobrenadante HPLC-MS/MS rupive.
Oñembotuichave umi fragmento PCR EPP (362 pb), EcK1 (AGAP004574, 365 pb) ha EcK2 (556 pb)-pe guarã ADNc oñembosako’iva’ekue ñati’ũ retekue iñakã’ỹva sexo mixto-gui.Oñembotuichave pe fragmento PCR control eGFP rehegua (495 pb) pCR2.1-eGFP oñemombe’u va’ekuégui yma; Umi cebador PCR rehegua ojehechauka cuadro de Datos Extendidos 2-pe.Oñemoinge pe fragmento PCR umi promotor T7 invertido apytépe plásmido pL4440 rehe.Ojerecupera umi constructo plásmido rehegua E. coli competente NEB 5-α-gui (New England Biolabs) ha ojehechauka secuenciación ADN rupive ojeporu mboyve (ehecha Datos Suplementario 1 secuencia de inserto rehegua).Umi cebador ojoaju promotor T7 ndive (Tabla de Datos Extendidos 2) ojeporu oñembotuichave haguã inserto plásmido basado pL4440-gui.Oñemoañete producto PCR tuichakue electroforesis gel agarosa rupive.oñembohasa ARNds plantilla PCR-gui ojeporúvo Kit de Transcripción Megascript T7 (Thermo Fisher) ha oñembopoty fabricante he'iháicha umi modificación oñemombe'uva'ekue yma.
ARNds inyección-pe guarã, oñeinyecta 1.380 ng ARNds (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) concentración 10 ng nl-1-pe tórax kuimba e térã kuña kakuaávape (Nanoject III, Drummond) 1 ára eclosión rire.Ojedetermina niveles de knockdown génico por lo menos mbohapy réplica biológica ARN rupive extracción, síntesis ADNc, ha RT-qPCR.Ecdisona inyecciónpe guara, kuña vírgen 4 ára térã vírgen oñemongarúva tuguy reheve oñeinyecta 0,13, 0,21 térã 0,63 μg 20E térã 3D20E (Nanoject III, Drummond) concentración 1,3, 2,1, . petettet, odependéva diseño experimental rehe téra 6,3 ng nl-1.Oinyecta 100 nl etanol 10% (vol/vol) ýpe; 100 nl 3D20E22P etanol 10%-pe (ojoja 75% pe ojejuhúvagui peteî par MAG-pe).Oñeasigna aleatoriamente ñati'û grupo inyección-pe.
Umi ensayo de desove-pe guarã, kuña orekóva 3 ára oñemongaru ad libitum yvypóra ruguy rehe.Ojepe'a umi ñati'ũ oñemongarúva parcialmente térã noñemongarúiva.Odepende tratamiento rehe, kuña oñemoĩ vaso de desove separado-pe irundy pyhare por lo menos 48 aravo'i okaru rire tuguy.Ojeipapa huevo estereoscopio rupive (Stemi 508, Zeiss); kuña oñeapareávape g̃uarã, umi óvulo osẽva larva-pe ojehecha fértil.
Umi ensayo de apareamiento-pe guarã, ojeheja kuñanguérape por lo menos 2 día odependéva tratamiento rehe odesarrolla haguã resistencia apareamiento-pe, ha upéi oñemoinge umi kuimba'e tipo silvestre edad ojoajúva peteî jaula-pe.Mokõi pyhare rire, ojedisecciona umi vesícula fecundada kuña ha ojepoi ADN genómico congelación-descongelación ha sonicación rupive peteî tampón orekóva 10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, ha NaCl 25 mM (pH 8,2).Oñeincuba muestra Proteinasa K (0,86 μg μl-1) ndive 15 minuto 55 °C-pe, upéi 10 minuto 95 °C-pe.Oñembohyru 10 jey umi preparación ADN genómico crudo ha oñembohasa detección qPCR secuencias cromosomas Y rehegua; umi cebador oñemoĩ Datos Extendidos-pe Cuadro 2.Ndaipóriramo secuencia cromosoma Y ohechauka ndaiporiha apareamiento.
Umi ensayo re-apareamiento-pe guarã, ojehecha umi kuña oñeapareáva mbaretépe oîpa tapón de apareamiento omoañete haguã estado de apareamiento ha ojeheja 2 ára odesarrolla refractoriedad apareamiento-pe ndaipóri ramo kuimba'e, oje'e haguéicha yma 36 .Upéi oñemoinge kuña jaula-pe umi kuimba'e ogueraháva espermatozoide transgénico DsRed.Mokõi pyhare rire, oñemoinge umi vesícula fertilizante ojedisecciona kuñágui, ha oñembosako i ADN genómico oje e haguéicha yvateve ha ojejapo detección qPCR-pe pe transgén DsRed rehegua; umi cebador oñemoĩ cuadro de Datos Extendidos-pe 2.Ndaipóri ramo pe transgén DsRed ohechauka ndoikói hague re-apareamiento.
Oñesintetiza 3D20E oje e haguéicha yma 37 .Mbykymi, ojejoso 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) 10 ml ýpe, upéi oñembojehe a 30 mg platino morotî (en forma de polvo, Sigma-Aldrich).Oñembopupu meme petet corriente suave O2 rehegua pe mezcla de reacciónpe, oñembopupu kotype temperatura.Ohasávo 6 aravo, oñembojehe a 30 mL metanol ojejoko hagua pe reacción.Oñecentrifugá pe mezcla ojeipe a hagua umi partícula catalizador rehegua.Oñembopiro y pe sobrenadante seco peve vacíope temperatura ambientepe.Ojejoso pe producto reacción seco etanol 10% ha metanolpe inyecciónpe ojejapo hagua análisis HPLC-MS/MS.Pe tasa de conversión (20E guive 3D20E) ha e kuri 97% rupi (Fig. 4b), ha espectro MS 3D20E oñesintetizava ekue ojoaju ojejuhúva kuña oñeapareávape (Fig. 4c).
Pe leyenda oguereko detalle específico umi prueba estadística ojejapóva rehegua.Ojeporu GraphPad (versión 9.0) ojejapo hagua prueba exacta Fisher, prueba Mantel-Cox ha prueba t Student.Umi prueba Cochran-Mantel-Haenszel ojejapo ojeporúvo script R personalizado (ojeguerekóva https://github.com/duopeng/mantelhaen.test).Ojeproba pe distribución de datos normalidad oiporúvo prueba Shapiro-Wilk orekóva umbral de significancia 0,05.Umi dato ofalla jave prueba de normalidad, ojejapo prueba Mann-Whitney.Oñeanalisa umi dato sobrevivencia ojeporúvo prueba Mantel-Cox.Ojeporu paquete DESeq2 (versión 1.28.1) ojejapo haguã análisis de expresión diferencial nivel gen ARN-seq.Pe barra horizontal gráfico-pe ohechauka mediana.A ojeporu umbral ramo valor de significación P = 0,05 opaite prueba-pe guarã.
Ojekuaave hag̃ua mbaʼéichapa ojejapo pe estúdio, ehecha pe Informe de Investigación de la Naturaleza resumen ojoajúva ko artíkulore.
Umi dato proteómico MS rehegua oñeñongatu Consorcio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org)-pe, PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) rupive, identificador conjunto de datos PXD032157 reheve.
Pe conjunto de datos ARN-seq oñeñongatu Biblioteca Integral de Expresión Génica-pe (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) registro serie GSE198665 guýpe.
Umi conjunto de datos adicional oñegeneráva ha/térã oñeanalisáva estudio ko'ágãgua jave ikatu ojehupyty umi autor correspondiente-gui ojejerurévo razonable.Ko artículo ome'ë umi dato fuente.
De Loof, A. Ecdisteroides: Esteroides sexuales insectos ojehejareíva?Kuimba’e: Caja Negra.Ciencia de Insectos.13, 325–338 (2006).
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