Umi metabolito inmunomodulatorio ha’e peteĩ mba’e iñimportantevéva microambiente tumoral (TME)-pe, ha katu mbovymi excepción reheve, tuicha ndojekuaái identidad orekóva. Ko'ápe, roanalisa tumor ha célula T umi tumor ha ascitis umi paciente orekóva carcinoma seroso de alto grado (HGSC) ojekuaa haguã metabólomo ko'ã compartimiento TME iñambuéva. Ascitis ha célula tumoral oguereko tuicha diferencia metabolito rehegua. Oñembojojávo ascitis rehe, umi célula T oinfiltráva tumor-pe tuicha oñembohetave 1-metilnicotinamida (MNA)-pe. Jepémo ojupi pe nivel de MNA umi célula T-pe, pe expresión nicotinamida N-metiltransferasa (peteĩ enzima catalizador transferencia de grupos metilo S-adenosilmetionina-gui nicotinamida-pe) oñemboty fibroblasto ha célula tumoral-pe. Funcionalmente, MNA omoheñói células T osecreta haguã citoquina omokyre'ÿva tumor factor necrosis tumoral alfa. Upévare, MNA derivado TME-gui oipytyvõ regulación inmune células T ha orepresenta potencial blanco inmunoterapia oñepohano haguã cáncer yvypóra.
Umi metabolito oúva tumor-gui ikatu oreko peteĩ efecto inhibidor profundo inmunidad antitumoral-pe, ha hetave evidencia ohechauka ikatuha avei oservi peteĩ fuerza impulsora clave ramo mba’asy progresión-pe (1). Omotenondévo efecto Warburg, tembiapo nda'areiete oñepyrü okarakterisa estado metabólico células tumorales ha relación orekóva estado inmunológico microambiente tumoral (TME). Umi estudio ojejapóva umi modelo de ratón ha célula T yvypóra rehegua ohechauka pe metabolismo glutamina rehegua (2), metabolismo oxidativo (3) ha metabolismo glucosa rehegua (4) ikatuha oactua independientemente opaichagua subgrupo de células inmunes rehe. Heta metabolito ko'ã tape rehegua ombotove célula T rembiapo antitumoral. Ojehechakuaa pe bloqueo coenzima tetrahidrobiopterina (BH4) rehegua ikatuha ombyai umi célula T proliferación, ha pe BH4 ojupíramo ñande retepýpe ikatu omombarete pe respuesta inmune antitumoral mediada CD4 ha CD8 rupive. Avei, pe efecto inmunosupresor kynurenina rehegua ikatu ojesalva oñeme’ẽvo BH4 (5). Glioblastoma mutante isocitrato deshidrogenasa (IDH)-pe, pe secreción enantiometabólico (R)-2-hidroxiglutarato (R-2-HG) ombotove célula T activación, proliferación ha citolisis Actividad (6). Nda’aréi ojehechauka metilglioxal, subproducto glicólisis rehegua, ojejapoha umi célula supresor origen mieloide rehegua, ha pe célula T ñembohasa metilglioxal rehegua ikatu ombotove célula T efectora rembiapo. Pe tratamiento-pe, pe neutralización metilglioxal rehegua ikatu osupera pe actividad células supresor derivadas de mieloides (MDSC) ha sinégicamente omombarete terapia bloqueo punto de control rehegua umi modelo de ratón-pe (7). Ko'ã estudio omomba'e guasu colectivamente rol clave orekóva metabolito derivado TME oreguláva función ha actividad célula T.
Ojekuaa hetaiterei célula T disfunción cáncer de ovario-pe (8). Péva ojehu en parte umi característica metabólica inherente hipoxia ha vasculatura tumoral anormal (9), péva oreko resultado oñekonverti glucosa ha triptófano subproducto ha'eháicha ácido láctico ha kynurenina. Lactato extracelular hetaiterei omboguejy interferón-γ (IFN-γ) producción ha omotenonde diferenciación subgrupo mielosupresivo ( 10 , 11 ). Pe triptófano je’u ojoko directamente célula T proliferación ha ombotove señalización receptor célula T rehegua ( 12-14 ). Jepémo ko’ã mba’e ojehechakuaáva, heta tembiapo ojeréva metabolismo inmunológico rehe ojejapo cultivo de células T in vitro-pe ojeporúvo medio optimizado, térã oñelimitáva modelo de ratón homólogo in vivo-pe, ni peteĩva ndohechaukái plenamente heterogeneidad cáncer yvypóra rehegua ha macro ha micro ambiente Fisiológico.
Peteĩ mba’e ojehechavéva cáncer de ovario-pe ha’e pe peritoneal ñemyasãi ha ojehecha ascitis. Pe acumulación de líquido celular ascitis-pe ojoaju mba’asy avanzada ha pronóstico vai rehe (15). Ojekuaaháicha, ko compartimiento ijojaha'ÿva ha'e hipóxico, oreko nivel yvate factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ha indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), ha oike células reguladoras T ha células inhibidoras mieloides (15-18). Pe ambiente metabólico ascitis rehegua ikatu iñambue pe tumor-gui voi, upévare nahesakãporãi pe reprogramación células T rehegua espacio peritoneal-pe. Avei, umi diferencia clave ha heterogeneidad oîva ascitis ha metabolito oîva tumor ambiente-pe ikatu ohapejoko infiltración células inmunes ha función orekóva tumor-kuéra rehe, ha oñeikotevê investigación ambue.
Ikatu haguãicha oñesolusiona ko'ã apañuãi, rodiseño peteî método separación celular sensitiva ha cromatografía líquida espectrometría de masas tándem (LC-MS/MS) roestudia haguã diferentes tipos de células (oikehápe células T CD4 + ha CD8 +) avei tumor ryepýpe ha mbytépe Imetabolitos oñemosarambi células peteîchagua ascitis ha ambiente tumoral paciente-pe. Roipuru ko método ojoajúvo citometría de flujo alta dimensional ha secuenciación ARN célula única (scRNA-seq) ome'ë haguã retrato altamente resolución estado metabólico ko'ã población clave. Ko método ohechauka tuicha ojupiha pe nivel 1-metilnicotinamida (MNA) rehegua umi célula T tumoral-pe, ha umi experimento in vitro ohechauka ndojekuaái hague yma pe efecto inmunomodulador orekóva MNA función célula T rehe. En general, ko método ohechauka umi interacción metabólica mutua tumor ha célula inmune apytépe, ha ome'ë jesareko ijojaha'ÿva metabolito regulación inmune rehe, ikatúva ideprovécho tratamiento inmunoterapia cáncer de ovario basado célula T Oportunidad Tratamiento.
Roipuru citometría de flujo alta dimensional rocuantifika haguã simultáneamente glucosa jegueraha [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-desoxiglucosa (2-NBDG) ha actividad mitocondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) oime típico ojoykére umi marcador ombojoavyva célula inmune ha población célula tumoral (Tabla S2 ha Figura S1A). Ko análisis ohechauka oñembojojávo célula T rehe, ascitis ha célula tumoral oreko nivel de absorción glucosa yvateve, pero oreko diferencia michîvéva actividad mitocondrial-pe. Pe glucosa jegueraha promedio umi célula tumoral-pe [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ha e mbohapy ha irundy jey umi célula T-gui, ha pe glucosa jegueraha promedio umi célula T CD4 +-pe ha e 1,2 jey umi célula T CD8 +-gui, upéva ohechauka umi linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) oguerekoha iñambuéva requisito metabólico peteĩchagua TME-pe jepe (Figura 1A). Ojoavy, actividad mitocondrial célula tumoral-pe ojogua umi célula CD4 + T-pe, ha actividad mitocondrial mokõive tipo de célula-pe tuichave umi célula CD8 + T-gui (Ta anga 1B). En general, ko'ã resultado ohechauka nivel metabólico. Pe actividad metabólica célula tumoral rehegua tuichave umi célula T CD4 +-gui, ha pe actividad metabólica célula T CD4 + rehegua tuichave umi célula T CD8 +-gui. Jepémo ko ã mba e ojejapo opaichagua célula rupi, ndaipóri diferencia constante estado metabólico células T CD4 + ha CD8 + térã proporción relativa orekóva ascitis-pe oñembojojávo tumor rehe (Figura 1C). Ojoavy, fracción célula CD45-pe, proporción células EpCAM+ tumor-pe ojupi oñembojojávo ascitis rehe (Figura 1D). Avei rohechakuaa peteĩ diferencia metabólica hesakãva umi componente célula EpCAM+ ha EpCAM- apytépe. Umi célula EpCAM+ (tumor) oguereko tuichave glucosa jegueraha ha actividad mitocondrial umi célula EpCAM-gui, tuicha tuichave pe actividad metabólica fibroblastos rehegua umi célula tumoral TME-pe (Ta anga 1, E ha F).
(A ha B) Intensidad mediana de fluorescencia (MFI) glucosa jegueraha (2-NBDG) (A) ha actividad mitocondrial células T CD4 + (MitoTracker pytã hũ) (B) Gráfico representativo (izquierda) ha dato tabulado (Derecha), células T CD8 + ha células EpCAM + CD45-tumor ascitis ha tumor-gui. (C) Pe relación célula CD4 + ha CD8 + (células T CD3 + rehegua) ascitis ha tumor-pe. (D) Proporción célula tumoral EpCAM + rehegua ascitis ha tumor-pe (CD45−). (E ha F) EpCAM + CD45-tumor ha EpCAM-CD45-matriz glucosa jegueraha (2-NBDG) (E) ha actividad mitocondrial (MitoTracker pytã hũ) (F) gráfico representativo (izquierda) ha dato tabulado ( Derecha) Ascitis ha células tumorales. (G) Gráfico representativo CD25, CD137 ha PD1 expresión rehegua citometría de flujo rupive. (H ha I) CD25, CD137 ha PD1 expresión células T CD4 + (H) ha células T CD8 + (I) rehe. (J ha K) Fenotipos ingenuos, memoria central (Tcm), efector (Teff) ha memoria efector (Tem) oñemopyendáva expresión CCR7 ha CD45RO rehe. Ta anga representativa (izquierda) ha dato tabular (derecha) células T CD4 + (J) ha células T CD8 + (K) ascitis ha tumores-pe. Umi valor P ojedetermináva prueba t pareada rupive (*P<0,05, **P<0,01 ha ***P<0,001). Pe línea ohechauka umi paciente ojoajúva (n = 6). FMO, fluorescencia menos peteĩ; IMF, intensidad fluorescencia mediana rehegua.
Ojejapove análisis ohechauka ambue diferencia significativa estado fenotípico célula T altamente resuelta apytépe. Pe memoria activada (Ta anga 1, G guive I peve) ha efector (Ta anga 1, J ha K) umi tumor-pe, heta hetave pe ascitis-gui (proporción de células T CD3 +). Upéicha avei, oñeanalisávo fenotipo expresión marcador activación (CD25 ha CD137) ha marcador depleción [proteína de muerte celular programada 1 (PD1)] ohechauka jepénte umi característica metabólica ko'ã población iñambue (Figura S1, B a E) , Pero ndojehechái constantemente diferencia metabólica significativa subconjunto ingenuo, efector térã memoria (Figura S1, F a I). Ko'ã resultado oñemoañete ojeporúvo método de aprendizaje automático oasigna haguã automáticamente fenotipos celulares (21), péva ohechaukave oîha hetaiterei célula médula ósea (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ascitis paciente-pe (Figura S2A). Opaite célula ojehechakuaáva apytépe, ko población célula mieloide ohechauka glucosa jegueraha ha actividad mitocondrial ijyvatevéva (Ta anga S2, B guive G peve). Ko'ã resultado omomba'e guasu diferencia metabólica mbarete umi múltiple tipo de célula ojejuhúva ascitis ha tumor umi paciente HGSC-pe.
Pe desafío principal oñentende haguã umi característica metabonómica TIL ha'e tekotevêha ojeipe'a muestra célula T orekóva suficiente pureza, calidad ha cantidad umi tumor-gui. Umi estudio nda’aréi ojejapóva ohechauka umi método de clasificación ha enriquecimiento de cuentas oñemopyendáva citometría de flujo-pe ikatu ogueru cambio umi perfil metabolito celular-pe ( 22-24 ). Ojesupera hagua ko problema, rooptimiza pe método enriquecimiento de cuentas roipe a ha roipe a hagua TIL cáncer de ovario humano resecado quirúrgicamentegui ojejapo mboyve análisis LC-MS/MS rupive (ehecha Materiales y Métodos; Figura 2A). Ikatu haguã ojehecha impacto general ko protocolo umi cambio metabolito rehe, rombojoja umi perfil metabolito célula T activada donante saludable rire paso de separación de cuentas yvate umi célula ndaha'éiva separada cuenta pero opytáva hielo ári. Ko análisis control de calidad ojuhu oîha peteî correlación yvate ko'ã mokõi condición (r = 0,77), ha repetibilidad técnica grupo 86 metabolito orekóva repetibilidad yvate (Figura 2B). Upévare, ko'ã método ikatu ojapo análisis metabolito hendaitépe umi célula ohasáva enriquecimiento tipo celular, péicha ome'ë peteîha plataforma de alta resolución ojehechakuaa haguã metabolito específico HGSC-pe, upéicha umi tapicha ohupyty entendimiento pypuku especificidad celular Programa metabolismo sexual.
(A) Diagrama esquemático enriquecimiento perla magnética rehegua. Ojejapo mboyve análisis LC-MS/MS rupive, umi célula ohasáta mbohapy ronda consecutiva enriquecimiento perla magnética térã opyta hielo ári. (B) Pe efecto oguerekóva tipo de enriquecimiento umi metabolito abundancia rehe. Pe promedio mbohapy medición rehegua petettet tipo de enriquecimiento rehegua ± SE. Pe línea gris ohechauka peteĩ relación 1:1. Pe correlación intraclase (ICC) umi medición ojejapóva jey jey rehegua ojehechaukáva etiqueta eje rehegua. NAD, nicotinamida adenina dinucleótido rehegua. (C) Diagrama esquemático mba éichapa ojejapo tembiapo análisis metabolito paciente rehegua. Oñembyaty ascitis térã tumor umi hasývagui ha oñeñongatu criopreserva. Peteî porción michîmi peteîteî muestra-gui oñeanalisa citometría de flujo rupive, ha umi muestra hembýva ohasa mbohapy ronda de enriquecimiento células CD4+, CD8+ ha CD45--pe guarã. Ko'ã fracción celular oñeanalisa ojeporúvo LC-MS/MS. (D) Mapa haku rehegua abundancia metabolito estandarizado rehegua. Pe dendrograma ohechauka Ward agrupación umi distancia euclídea muestra apytépe. (E) Análisis componente principal (APC) mapa metabolito muestra rehegua, ohechaukáva mbohapy réplica peteîteî muestra rehegua, muestra peteî paciente-gui oñembojoaju peteî línea rupive. (F) PCA perfil metabolito muestra rehegua oñecondicionava’ekue paciente rehe (he’iséva, ojeporúvo redundancia parcial); pe tipo de muestra oñemombyte pe casco convexo rupive. PC1, componente principal 1 rehegua; PC2, componente principal 2 rehegua.
Upe rire, roipuru ko método enriquecimiento rehegua roanalisa hagua 99 metabolito umi fracción célula CD4 +, CD8 + ha CD45-pe umi ascitis ha tumor primaria seis paciente HGSC-pegua (Figura 2C, Figura S3A ha Cuadro S3 ha S4). Población de interés oreko 2% ha 70% muestra tuicháva original células oikovéva, ha proporción células tuicha iñambue umi paciente apytépe. Ojesepara rire umi cuenta, pe fracción enriquecida de interés (CD4+, CD8+ térã CD45-) oguereko hetave 85% opaite célula oikovéva muestra-pe en promedio. Ko método enriquecimiento rehegua ñandepermiti ñaanalisa umi población celular metabolismo tejido tumoral humano-gui, ndaikatúiva ojejapo muestra tuichávagui. Oipurúvo ko protocolo, rodetermina l-quinurenina ha adenosina, ko'ã mokõi metabolito inmunosupresivo ojekarakterisa porãva ojeipyso célula T tumoral térã célula tumoral-pe (Figura S3, B ha C). Upévare, ko'ã resultado ohechauka fidelidad ha capacidad orekóva ñande separación celular ha tecnología espectrometría de masas ojuhúvo metabolito biológicamente importante umi tejido paciente-pe.
Ore análisis ohechauka avei separación metabólica mbarete umi tipo celular umi paciente ryepýpe ha apytépe (Figura 2D ha Figura S4A). En particular, oñembojojávo ambue paciente rehe, paciente 70 ohechauka característica metabólica iñambuéva (Figura 2E ha Figura S4B), ohechaukáva ikatuha oî heterogeneidad metabólica sustancial umi paciente apytépe. Iporã ojehechakuaa oñembojojávo ambue hasýva rehe (1,2 a 2 litro; Cuadro S1), pe cantidad total de ascitis oñembyatýva paciente 70-pe (80 ml) michĩve. Pe control heterogeneidad interpaciente rehegua ojejapo jave análisis componente principal rehegua (techapyrã, ojeporúvo análisis de redundancia parcial) ohechauka umi cambio constante umi tipo celular apytépe, ha umi tipo celular ha/térã microambiente oñembyaty hesakã porã según pe perfil metabolito rehegua (Figura 2F). Pe análisis metabolito único rehegua omomba’eguasu ko’ã efecto ha ojekuaa tuicha ojoavyha ​​umi tipo celular ha microambiente apytépe. Iporã jaikuaa pe joavy tuichavéva ojehechakuaáva ha e MNA, jepivegua oñembohetavéva célula CD45--pe ha umi célula CD4+ ha CD8+ oikeva tumor-pe (Ta anga 3A). Umi célula CD4 +-pe guarã, ko efecto ojehecha porãve, ha pe MNA oĩva umi célula CD8 +-pe ha’ete avei ojeafectáva mbarete tekoha rehe. Ha katu péva ndaha’éi iñimportánteva, pórke mbohapynte umi seis hasývagui ikatu ojeevalua umi puntuación tumoral CD8+ rehegua. MNA ári, opaichagua célula ascitis ha tumor-pe, ambue metabolito ojehechaukáva vai TIL-pe, oguereko avei diferencialmente rico (Ta anga S3 ha S4). Upévare, ko'ã dato ohechauka peteî conjunto prometedor metabolitos inmunomoduladores investigación-pe guarã.
(A) Contenido normalizado MNA rehegua umi célula CD4+, CD8+ ha CD45--pe oúva ascitis ha tumor-gui. Pe gráfico cuadro rehegua ohechauka mediana (línea), rango intercuartílico (bisagra marco) ha rango de datos, 1,5 jey peve pe rango intercuartílico (bargo de marco). Oje eháicha Materiales y Métodos de Pacientes-pe, ojepuruva era pe paciente valor limma ojekuaa hagua pe valor P (*P<0,05 ha **P<0,01). (B) Diagrama esquemático metabolismo MNA rehegua (60). Metabolitos: S-adenosil-1-metionina rehegua; SAH, S-adenosina-1-homocisteína rehegua; NA, nicotinamida rehegua; MNA, 1-metilnicotinamida rehegua; 2-PY, 1-metil- 2-piridona-5-carboxamida rehegua; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-carboxamida rehegua; NR, nicotinamida ribosa rehegua; NMN, nicotinamida mononucleótido rehegua. Enzimas (hovy): NNMT, nicotinamida N-metiltransferasa; SIRT, sirtuins rehegua; NAMPT, nicotinamida fosforibosil transferasa rehegua; AOX1, aldehído oxidasa 1 rehegua; NRK, nicotinamida ribosido quinasa rehegua; NMNAT, nicotinamida mono Nucleótido adenilato transferasa rehegua; Pnp1, purina nucleósido fosforilasa rehegua. (C) t-SNE de scARN-seq de ascitis (gris) ha tumor (rojo; n = 3 paciente). (D) NNMT expresión opaichagua población celular ojehechakuaáva ojeporúvo scARN-seq. (E) Expresión NNMT ha AOX1 rehegua SK-OV-3-pe, riñón embrionario humano (HEK) 293T, células T ha células T oñeñangareko va ekue MNA rehe. Pe expresión ojedobláva ojehechauka SK-OV-3 rehe. Ojehechauka pe patrón de expresión SEM ndive (n = 6 donante hesãiva). Umi valor Ct tuichavéva 35-gui ojehecha indetectable (UD). (F) Expresión SLC22A1 ha SLC22A2 rehegua SK-OV-3, HEK293T, células T ha células T oñeñangarekóva MNA 8mM rehe. Pe expresión ojedoblava ojehechauka SK-OV-3 rehe. Ojehechauka pe patrón de expresión SEM ndive (n = 6 donante hesãiva). Umi valor Ct tuichavéva 35-gui ojehecha indetectable (UD). (G) Contenido MNA celular rehegua umi célula T donante hesãiva activada-pe 72 aravo oñeincuba rire MNA ndive. Ojehechauka pe patrón de expresión SEM ndive (n = 4 donante hesãiva).
MNA ojejapo oñembohasávo pe grupo metilo S-adenosil-1-metionina (SAM)-gui nicotinamida (NA)-pe nicotinamida N-metiltransferasa rupive (NNMT; Figura 3B). NNMT ojehechauka hetaiterei opaichagua cáncer yvypóra rehegua ha ojoaju proliferación, invasión ha metástasis rehe (25-27). Ojekuaa porãve haguã MNA fuente umi célula T TME-pe, roiporu scRNA-seq rokarakterisa haguã expresión NNMT opavave tipo celular ascitis ha tumor mbohapy paciente HGSC-pe (Tabla S5). Análisis 6.500 célula rupi ohechauka ascitis ha tumor ambiente-pe, expresión NNMT ojerestringe umi presunto población fibroblasto ha célula tumoral (Figura 3, C ha D). Iporã ojehechakuaa ndaiporiha expresión NNMT ojehechakuaáva mba'eveichagua población oikuaaukáva PTPRC (CD45 +) (Figura 3D ha Figura S5A), ohechaukáva MNA ojejuhúva espectro metabolito-pe oñemoinge célula T-pe. Pe aldehído oxidasa 1 (AOX1) jehechauka omoambue MNA 1-metil-2-piridona-5-carboxamida (2-PYR) térã 1-metil-4-piridona-5-carboxamida (4- PYR)-pe; Figura 3B) ojejoko avei población fibroblasto oikuaaukáva COL1A1 (Figura S5A), oñondive ohechauka umi célula T ndorekóiha capacidad metabolismo MNA convencional. Ojeverifika patrón de expresión ko'ã genes relacionados MNA ojeporúvo mokõiha conjunto de datos celular independiente ascitis umi paciente HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Avei, análisis cuantitativo reacción en cadena polimerasa (qPCR) umi célula T donante hesãiva oñeñangarekóva MNA rehe ohechauka oñembojojávo célula tumoral ovaria SK-OV-3 control rehe, haimete ndojehechái NNMT térã AOX1 (Figura 3E). Ko'ã resultado oñeha'ãrõ'ÿva ohechauka MNA ikatuha ojesecreta fibroblasto térã tumor-gui células T ojoykére TME-pe.
Jepémo umi candidato oike familia transportador cationico orgánico 1 a 3 (OCT1, OCT2 ha OCT3) codificado familia portador soluble 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 ha SLC22A3), umi transportador potencial MNA noñedefiníri gueteri (28) . QPCR ARNm células T donantes hesãiva ohechauka niveles de expresión bajo SLC22A1 pero niveles indetectables SLC22A2, omoañetéva oñemombe'u hague yma literatura-pe (Figura 3F) (29). Ojoavy, línea celular tumor ovario SK-OV-3 oikuaauka nivel yvate mokõive transportador (Figura 3F).
Ikatu haguã ojehecha posibilidad umi célula T oguerekoha capacidad oabsorve haguã MNA extranjero, oñemongakuaa células T donantes hesãiva 72 aravo pukukue oî jave diferente concentración MNA. Ndaipóriramo MNA exógeno, ndaikatúi ojehechakuaa pe contenido celular MNA rehegua (Ta anga 3G). Ha katu umi célula T activada oñeñangarekóva MNA exógena rehe ohechauka aumento dependiente dosis-gui contenido MNA umi célula-pe, MNA 6 mM peve (Figura 3G). Ko resultado ohechauka jepénte oî nivel bajo expresión transportadora ha ndaipóri enzima principal responsable metabolismo intracelular MNA rehe, TIL ikatu gueteri oipyhy MNA.
Pe espectro metabolito-kuéra rehegua oĩva umi paciente célula T-pe ha umi experimento absorción MNA in vitro rehegua ombohetave posibilidad umi fibroblasto asociado cáncer-pe (CAF) osẽha MNA ha umi célula tumoral ikatu oregula fenotipo ha función TIL rehegua. Ojekuaa hagua mba éichapa oñemomba e MNA umi célula T rehe, oñeactiva in vitro umi célula T donante hesãiva oĩ térã ndaipóri jave MNA, ha ojehecha iproliferación ha citoquina producción. Ohasávo 7 ára oñembojehe ávo MNA dosis ijyvatevévape, oñemboguejy moderadamente pe número de duplicación población rehegua, ha katu oñemantene vigor opaite dosis-pe (Figura 4A). Avei, tratamiento MNA exógena rehegua, ojupi pe proporción células T CD4 + ha CD8 + oikuaaukáva factor de necrosis tumoral-α (TNFα; Figura 4B). Ojoavy, producción intracelular IFN-γ rehegua tuicha oñemboguejy umi célula CD4 + T-pe, ha katu ndaha éi umi célula T CD8 +-pe, ha ndaipóri ñemoambue tuicha interleucina 2-pe (IL-2; Figura 4, C ha D). Upévare, ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) umi sobrenadante ko ã cultura célula T tratada MNA rehe ohechauka tuicha ojupiha TNFα, oguejy IFN-γ ha noñemoambuéi IL-2 (Ta anga 4, E guive G peve). . Pe IFN-γ oguejy ohechauka MNA ikatuha oguereko peteĩ tembiapo ombotovévo pe actividad antitumoral umi célula T rehegua. Ojesimula haguã efecto orekóva MNA citotoxicidad mediada célula T rehe, umi célula receptor antígeno quimérico T (FRα-CAR-T) ojepytasóva receptor folato α ha CAR-T (GFP) oreguláva células proteína fluorescente verde (GFP) -CAR-T) omoheñói células mononucleares de sangre periférica donante saludable (PBMC). Oñemongakuaa umi célula CAR-T 24 aravo pukukue MNA oĩ jave, ha upéi oñeñotỹ oñondive umi célula tumoral ovaria SK-OV-3 yvypóra ndive oikuaaukáva receptor folato α peteĩ relación efector ha blanco 10:1. Pe tratamiento MNA rehegua tuicha oguejy pe actividad ojuka hagua umi célula FRα-CAR-T, ojoguáva umi célula FRα-CAR-T oñeñangarekóva adenosina rehe (Figura 4H).
(A) Conteo total de células viables ha duplicación población (PD) directamente cultura guive ára 7. Pe gráfico de barras ohechauka media + SEM seis donante hesãiva rehegua. Ohechauka dato oúva por lo menos n = 3 experimento independiente-gui. (B a D) Ojeporu CD3/CD28 ha IL-2 ojeactiva hagua células T concentración MNA rehegua 7 ára pukukue. Ojejapo mboyve análisis, oñeestimula célula PMA/ionomicina reheve GolgiStop reheve 4 aravo aja. TNFα (B) jehechauka umi célula T-pe. Ta anga techapyrã (izquierda) ha dato tabular (derecha) TNFα expresión rehegua célula oikovévape. IFN-γ (C) ha IL-2 (D) jehechauka célula T-pe. Ojekuaa citoquina expresión citometría de flujo rupive. Pe gráfico de barras ohechauka pe media (n = 6 donante hesãiva) + SEM. Eipuru análisis de varianza unidireccional ha medida ojejapóva jey jey (*P<0,05 ha **P<0,01) ojekuaa hagua valor P. Ohechauka dato oúva por lo menos n = 3 experimento independiente-gui. (E a G) Ojeporu CD3/CD28 ha IL-2 oñeactiva hagua células T concentración MNA rehegua 7 ára pukukue. Oñembyaty pe medio 4 aravo estimulación PMA/ionomicina mboyve ha rire. Ojekuaa ELISA rupive umi concentración TNFα (E), IFN-γ (F) ha IL-2 (G) rehegua. Pe gráfico de barras ohechauka pe media (n = 5 donante hesãiva) + SEM. Valor P ojedetermináva ojeporúvo análisis de varianza unidireccional ha medición ojejapóva jey jey (*P<0,05). Pe línea punteada ohechauka pe límite de detección pe detección rehegua. (H) Ensayo de lisis celular rehegua. Umi célula FRα-CAR-T térã GFP-CAR-T oñemboheko adenosina (250μM) térã MNA (10 mM) reheve 24 aravo pukukue, térã ojeheja noñeñangarekói hese (Ctrl). Ojekuaa porcentaje ojejukáva célula SK-OV-3. P valor ojedetermináva prueba t Welch rupive (*P<0,5 ha **P<0,01).
Ojehupyty hagua peteî entendimiento mecánico regulación expresión TNFα dependiente MNA-gui, ojehecha umi cambio ARNm TNFα células T tratadas MNA rehe (Figura 5A). Umi célula T donante hesãiva oñeñangarekóva MNA rehe ohechauka mokõi jey ojupíha umi nivel de transcripción TNFα, ohechaukáva MNA odependeha regulación transcripcional TNFα rehe. Oñeinvestiga haguã ko mecanismo regulador ikatúva, mokõi factor de transcripción ojekuaáva oreguláva TNFα, ha'éva factor nuclear de células T activadas (NFAT) ha proteína específica 1 (Sp1), ojeevalua ombohováivo MNA ojoajúva promotor proximal TNFα ( 30 ). Pe promotor TNFα oguereko 6 tenda ojehechakuaáva ojoajuhápe NFAT ha 2 tenda ojoajuhápe Sp1, oñembojoajúva peteĩ tendápe [-55 pares de bases (bp) 5'cap-gui] (30). Inmunoprecipitación cromatina (ChIP) ohechauka oñeñangareko jave MNA rehe, Sp1 jejopy promotor TNFα rehe ojupi mbohapy jey. Avei NFAT jeike ojupi ha oñemboja importancia rehe (Ta anga 5B). Ko'ã dato ohechauka MNA oregula expresión TNFα transcripción Sp1 rupive, ha sa'ive medida expresión NFAT.
(A) Oñembojojávo umi célula T oñemongakuaava ekue MNA ÿre rehe, pe cambio de pliegue expresión TNFα rehegua umi célula T oñeñangarekóva MNA rehe. Ojehechauka pe patrón de expresión SEM ndive (n = 5 donante hesãiva). Ohechauka dato oúva por lo menos n = 3 experimento independiente-gui. (B) Oñembojoaju promotor TNFα célula T rehegua oñeñangareko va ekue MNA 8 mM reheve téra ÿre NFAT ha Sp1 rire (Ctrl) ha estimulación PMA/ionomicina ndive 4 aravo aja. Ojeporu inmunoglobulina G (IgG) ha H3 control negativo ha positivo ramo inmunoprecipitación-pe guarã, peteîteî. Pe cuantificación ChIP rehegua ohechauka pe Sp1 ha NFAT jejopy promotor TNFα rehe umi célula oñeñangareko va ekue MNA rehe ojupi heta jey oñembojojávo control rehe. Ohechauka dato oúva por lo menos n = 3 experimento independiente-gui. P valor ojedetermináva heta t-test rupive (*** P <0,01). (C) Oñembojojávo umi ascitis HGSC rehegua rehe, umi célula T (ndaha éiva citotóxica) ohechauka oñembohetaveha expresión TNF rehegua pe tumor-pe. Umi kolór orrepresenta diferénte hasývape. Umi célula ojehechaukáva ojejapo muestreo aleatoriamente 300 peve ha ojejitter oñemombyte hagua sobredibujo (** Padj = 0,0076). (D) Modelo propuesta MNA rehegua cáncer de ovario-pe guarã. MNA ojejapo célula tumoral-pe ha fibroblasto TME-pe ha ojegueraha célula T rupive. MNA ombohetave Sp1 jejopy TNFα promotor rehe, ogueraháva TNFα transcripción ha TNFα citoquina producción. MNA avei ojapo oguejy haguã IFN-γ. Ojejokóramo célula T rembiapo, sa’ive ojuka haguã ha oñembopya’e tumor okakuaa.
Ojekuaaháicha, TNFα oreko efecto antitumoral ha antitumoral odependéva frente ha trasero, pero oreko peteî rol ojekuaáva omokyre'ÿvo okakuaa ha metástasis cáncer de ovario ( 31-33 ). Ojekuaaháicha, concentración TNFα ascitis ha tejido tumoral umi paciente orekóva cáncer de ovario tuichave umi tejido benigno-gui ( 34-36 ). Mecanismo rehegua, TNFα ikatu omohenda activación, función ha proliferación glóbulos blancos rehegua, ha omoambue fenotipo células cáncer rehegua ( 37 , 38 ). Ojoajúva ko ã mba e ojejuhúva ndive, análisis de expresión génica diferencial ohechauka TNF oîha significativamente regulado yvate umi célula T-pe umi tejido tumoral-pe oñembojojávo ascitis rehe (Figura 5C). Pe aumento expresión TNF rehegua ojehecha umi población célula T orekóva fenotipo no citotóxico-pe añoite (Figura S5A). En resumen, ko'ã dato oipytyvõ jesareko MNA orekóva doble efecto inmunosupresivo ha promotor tumoral HGSC-pe.
Etiquetado fluorescente oñemopyendáva citometría de flujo rehe oiko chugui método principal ojestudia haguã metabolismo TIL. Ko ã estudio ohechauka oñembojojávo linfocitos periféricos tuguy rehegua térã células T órgano linfoide secundario-gui, TIL murino ha yvypóra oreko tendencia yvateve ogueraha haguã glucosa ( 4 , 39 ) ha pérdida mbeguekatúpe función mitocondrial ( 19 , 40 ). Jepémo rohechakuaa resultado ojoajúva ko estudio-pe, desarrollo clave ha'e ombojoja metabolismo células tumorales ha TIL peteîchagua tejido tumoral resecado. Ojoajúva alguno ko'ã marandu ojejapo va'ekue yma, umi célula tumoral (CD45-EpCAM +) oúva ascitis ha tumor-gui oreko tuichave glucosa jegueraha umi célula T CD8 + ha CD4 +-gui, oipytyvõva pe glucosa jegueraha yvate umi célula tumoral ikatuha oñembojoja célula T rehe. Pe concepto competencia célula T rehegua. TME. Ha katu pe actividad mitocondrial umi célula tumoral rehegua tuichave umi célula T CD8 +-gui, ha katu pe actividad mitocondrial ojogua umi célula T CD4 +-pe. Ko'ã resultado omombarete tema heñóiva metabolismo oxidativo tuicha mba'e célula tumoral-pe guarã ( 41 , 42 ). Avei he’i hikuái umi célula T CD8 + ikatuha oguerekove disfunción oxidativa umi célula T CD4 +-gui, térã umi célula T CD4 + ikatuha oipuru fuente de carbono ndaha’éiva glucosa omantene haguã actividad mitocondrial ( 43 , 44 ). Ojekuaava’erã ndorohechái hague joavy glucosa jegueraha térã actividad mitocondrial umi efector CD4 + T, memoria efector T ha célula memoria central T apytépe ascitis-pe. Upéicha avei, estado de diferenciación células T CD8 + tumores-pe ndorekói mba'eveichagua relación umi cambio glucosa jegueraha rehe, omomba'eguasúva diferencia significativa células T oñemongakuaava'ekue in vitro ha TIL yvypóra in vivo ( 22 ). Ko'ã observación oñemoañete avei ojeporúvo asignación automática población celular imparcial, ojekuaavéva células CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + orekóva absorción glucosa ha actividad mitocondrial yvatevéva células tumorales-gui ojeipysóva pero orekóva población celular activa Metabólica. Ko población ikatu orrepresenta subpoblación putativa células supresor mieloide térã células dendrítica plasmacitoide ojehechakuaáva análisis scARN-seq-pe. Jepémo mokõivéva oñemombe’u yvypóra tumor ovario-pe [45], oikotevẽ gueteri Tembiapove ha’e oñemombe’u haguã ko subpoblación mieloide.
Jepémo umi método oñemopyendáva citometría de flujo-pe ikatu omyesakã umi diferencia general glucosa ha metabolismo oxidativo rehegua umi tipo celular apytépe, ne’ĩra gueteri ojedetermina umi metabolito preciso omoheñóiva glucosa térã ambue fuente de carbono metabolismo mitocondrial-pe guarã TME-pe. Oñeasigna hagua metabolitokuéra oĩ térã ndaipóriha peteĩ subconjunto TIL oñeme ẽvape oikotevẽ purificación población celular rehegua pe tejido ojeipe a va ekuegui. Upévare, ñande método enriquecimiento celular oñembojoajúva espectrometría de masas rehe ikatu ome'ë jesareko umi metabolito enriquecido diferencialmente células T ha población célula tumoral ombojoajúva muestra paciente. Jepémo ko método oreko ventaja pe clasificación celular activada fluorescencia rupive, ciertas bibliotecas metabolitos ikatu ojeafectáva estabilidad inherente ha / térã tasa de rotación pya e rupi ( 22 ). Upéicharamo jepe, ore método ikatu ohechakuaa mokõi metabolito inmunosupresivo ojehechakuaáva, adenosina ha kynurenina, tuicha iñambuégui umi tipo de muestra apytépe.
Ore análisis metabonómico tumor ha subtipo TIL rehegua ome’ẽ hetave jesareko metabolito rembiapo rehegua TME ovario-pe. Primero, roiporúvo citometría de flujo, rohechakuaa ndaiporiha diferencia actividad mitocondrial-pe umi tumor ha células T CD4 + apytépe. Ha katu, análisis LC-MS/MS ohechauka tuicha cambio abundancia metabolito ko'ã población apytépe, ohechaukáva conclusión metabolismo TIL ha actividad metabólica general oikotevêva interpretación cuidadosa. Mokõiha, MNA ha’e pe metabolito tuichavéva ojoavyva umi célula CD45 ha célula T apytépe ascitis-pe, ndaha’éi tumor-kuérape. Upévare, compartimentación ha tumor ñemohenda ikatu oreko efecto iñambuéva metabolismo TIL rehe, omomba'eguasúva posible heterogeneidad peteî microambiente oñeme'êvape. Mbohapyha, expresión enzima productora MNA NNMT oñelimitáva principalmente CAF-pe, ha'éva células tumorales en menor medida, pero ojehecha niveles de MNA detectables células T derivadas tumorales-pe. Pe sobreexpresión NNMT rehegua CAF ovario-pe oguereko peteĩ efecto ojekuaáva omokyre’ỹva cáncer, en parte pe promoción metabolismo CAF rehegua, invasión tumoral ha metástasis ( 27 ). Jepémo pe nivel general TIL rehegua ha’e moderado, pe expresión NNMT rehegua CAF-pe ojoaju estrechamente pe subtipo mesenquimal Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) ndive, ojoajúva pronóstico vai rehe ( 27 , 46 , 47 ). Ipahápe, pe expresión enzima AOX1 responsable degradación MNA rehegua oñemboty avei población CAF-pe, upéva ohechauka umi célula T ndorekóiha capacidad ometabolisa haguã MNA. Ko'ã resultado oipytyvõ idea jepénte oñeikotevê oñemba'apove ojehecha haguã ko jejuhu, niveles altos de MNA células T-pe ikatu ohechauka oîha microambiente CAF inmunosupresor.
Ojehechávo nivel de expresión bajo umi transportador MNA ha umi nivel indetectable proteína clave oîva metabolismo MNA-pe, oñeha'ãrõ'ÿme oîha MNA células T-pe. Ni NNMT ni AOX1 ndaikatúi ojehechakuaa análisis scRNA-seq ha qPCR ojepytasóva mokõi cohorte independiente-pe. Ko'ã resultado ohechauka MNA noñesintetiza célula T rupive, sino ojeabsorbe TME ijerére. Umi experimento in vitro ohechauka umi célula T oguerekoha tendáre ombyaty haguã MNA exógena.
Ore estudio in vitro ohechauka MNA exógeno omoheñói expresión TNFα células T-pe ha omombarete unión Sp1 promotor TNFα rehe. Jepémo TNFα oguereko tembiapo antitumoral ha antitumoral, cáncer de ovario-pe, TNFα ikatu omokyre’ỹ cáncer de ovario okakuaa haguã (31-33). Pe neutralización TNFα rehegua cultura célula tumoral ovaria-pe térã pe eliminación señal TNFα rehegua umi modelo de ratón-pe ikatu omoporãve producción citoquina inflamatoria mediada TNFα-pe ha ombotove tumor okakuaa ( 32 , 35 ). Upévare, ko kásope, MNA oúva TME-gui ikatu oactua metabolito proinflamatorio ramo peteî mecanismo odependéva TNFα rupive bucle autocrino rupive, upéicha omokyre'ÿ ojehu ha oñemyasãi cáncer de ovario ( 31 ). Oñemopyendáva ko posibilidad, ojeestudia bloqueo TNFα ha'éva potencial agente terapéutico cáncer de ovario ( 37 , 48 , 49 ). Avei, MNA ombyai citotoxicidad células CAR-T umi célula tumoral ovaria-pe, ome'ëva ambue evidencia supresión inmune mediada MNA. Oñondive, ko'ã resultado ohechauka modelo oimehápe tumor ha células CAF osecreta MNA TME extracelular-pe. (i) TNF rupive cáncer de ovario okakuaa hagua ha (ii) MNA rupive, actividad citotóxica célula T rupive, kóva ikatu oguereko efecto tumoral doble (Figura 5D).
Oñemohu'ãvo, ojeporúvo combinación enriquecimiento celular pya'e, secuenciación célula única ha perfil metabólico, ko estudio ohechauka tuicha diferencia inmunometabolómica tumor ha célula ascitis umi paciente HGSC-pe. Ko análisis amplio ohechauka oîha joavy glucosa jegueraha ha actividad mitocondrial célula T apytépe, ha ohechakuaa MNA ha'eha metabolito regulador inmune autónomo ndaha'éiva célula. Ko'ã dato oreko impacto mba'éichapa TME ohypýi metabolismo célula T umi cáncer yvypóra. Jepémo oñemombe'u competencia directa nutriente rehegua célula T ha célula cáncer apytépe, umi metabolito ikatu avei oactua regulador indirecto ramo omokyre'ÿ haguã progresión tumoral ha ikatu ombogue umi respuesta inmune endógena. Pe descripción ambue rol funcional ko’ã metabolito regulador rehegua ikatu oipe’a estrategias alternativas omombaretévo respuesta inmune antitumoral.
Ojehupyty umi especímen paciente ha dato clínico repositorio tejido tumoral cáncer BC rupive orekóva certificación Red Canadiense de Repositorio de Tejido. Péicha protocolo omonéîva Comité de Ética de Investigación Cáncer BC ha Universidad de Columbia Británica (H07-00463), opavave especímen ha dato clínico paciente ohupytýva consentimiento escrito informado térã orenunsia formalmente consentimiento orekóva. Umi muestra oñeñongatu BioBank certificado (BRC-00290)-pe. Umi paciente característica detallada ojehechauka cuadro S1 ha S5-pe. Criopreservación-pe guarã ojeporu bisturí ojedescompone haguã mecánicamente pe paciente muestra tumoral ha upéi ojeipyso filtro 100 micras rupive ojehupyty haguã suspensión celular añoite. Ojecentrifugákuri pe hasýva ascitis 1500 rpm-pe 10 minuto aja 4°C-pe ojejapo hagua pellet umi célula ha ojeipe a hagua pe sobrenadante. Umi célula ojehupytýva tumor ha ascitis-gui oñeñongatu criopreserva suero humano AB inactivado 50% haku rupive (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ha 10% sulfóxido de dimetilo-pe. Ko'ã suspensión célula única oñeñongatúva ojedescongeláva ha ojeporu metabolómica ha determinación metabolito oñemombe'úva ko'ápe.
Pe medio completo oguereko 0,22 μm filtrado 50:50 suplementado RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) oñembojoapýva 10% suero AB humano inactivado haku rupive (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Penicilina Estreptomicina (PenStrep) solución (Thermo Fisher Scientific) ha 50 μMB-mercaptoetanol. AimV (Invitrogen) oñembojoapy Hepes 20 mM (Thermo Fisher Scientific) ha l-glutamina 2 mM (Thermo Fisher Scientific) reheve. Pe tampón de tinción citometro de flujo oguereko salina tamponada fosfato filtrado 0,22μm (PBS; Invitrógeno) oñembohetavéva suero humano AB inactivado haku rupive 3% (Sigma). Pe tampón enriquecimiento celular rehegua ojejapo PBS filtrado 0,22μm ha oñembojoapy suero AB humano inactivado haku rupive 0,5% (Sigma-Aldrich).
Medio completo 37°C-pe, oñemyatyrõ célula 10 nM MT DR ha 100 μM 2-NBDG reheve 30 minuto aja. Upe rire, oñemyatyrõ umi célula tinte de viabilidad eF506 reheve 4°C-pe 15 minuto aja. Ojesuspende jey umi célula FC Block (eBioscience) ha Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences)-pe, ojedilui tampón de tinción citometro de flujo-pe (he'iháicha fabricante), ha oñeincuba 10 minuto temperatura ambiente-pe. Oñemancha umi célula petet conjunto de anticuerpos reheve (Tabla S2) tampón de tinción citometría de flujo-pe 4°C-pe 20 minuto aja. Ojesuspende jey umi célula tampón de tinción citometría de flujo-pe (Cytek Aurora; configuración 3L-16V-14B-8R) oñeanalisávo mboyve. Eipuru SpectroFlo ha FlowJo V10 ehesaꞌoijo hag̃ua datokuéra celda jepapa rehegua, ha eipuru GraphPad Prism 8 emoheñói hag̃ua umi dato. Pe intensidad mediana de fluorescencia (MFI) 2-NBDG ha MT DR rehegua oñenormaliza log-pe, ha upéi ojeporu peteĩ prueba t pareada análisis estadístico-pe guarã oñeme’ẽ haguã cuenta umi paciente ojoajúva rehe. Ojepe’a opaite población oguerekóva mbovyve 40 mba’e ojehúva análisis-gui; emoinge peteĩ valor IMF 1 oimeraẽva valor negativo-pe g̃uarã ojejapo mboyve análisis estadístico ha dato jehechauka.
Ikatu haguã oñembojoaju estrategia de gating manual panel proceso yvategua, roiporu anotación completa yvyramáta restricción forma (FAUST) (21) rupive roasigna automáticamente célula población-pe omboyke rire célula omanóva FlowJo-pe. Rogestiona manualmente pe salida rombojoaju haĝua umi población ha’etévaicha oñemboja’óva (ombojoajúvo PD1+ células PD1-tumoral ndive) ha umi población ojeguerekóva. Káda muestra oguereko peteĩ promedio hetave 2% célula-gui, peteĩ total 11 población-pe g̃uarã.
Ojeporu centrifugación densidad gradiente ficoll ojeipe a hagua PBMC umi producto separación leucocitos rehegua (STEMCELL Technologies). Ojepe a células T CD8 + PBMC-gui ojeporúvo CD8 MicroBeads (Miltenyi) ha oñembotuichave medio completo-pe ojeporúvo TransAct (Miltenyi) 2 arapokõindy pukukue he iháicha fabricante. Ojeheja umi célula opyta 5 ára medio completo oguerekóva IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), ha upéi oñeestimula jey TransAct rupive. Ára 7-pe, he’iháicha fabricante, ojeporu MicroBeads CD45 humanos (Miltenyi) oñembohetave haguã célula mbohapy ronda consecutiva-pe. Umi célula oñemboja o análisis citometría de flujo rehegua (oje e haguéicha yvateve), ha un millón célula oñemboja o mbohapy jey ojejapo hagua análisis LC-MS/MS. Umi muestra oñemboguata LC-MS/MS rupive oje eháicha ko ápe. Roestima pe valor metabolito ofaltáva orekóva número de iones 1.000. Káda muestra oñenormalisáva número total de iones (TIC) rupive, oñekonverti logarítmicamente ha oñenormalisáva automáticamente MetaboAnalystR-pe oñeanalisávo mboyve.
Ojedescongeláva suspensión célula única peteîteî paciente rehegua ha ojefiltra filtro 40 μm rupive medio completo-pe (ojehechaháicha yvate). Péicha protocolo fabricante, ojeporu mbohapy ronda consecutiva selección positiva separación magnética de cuentas ojeporúvo MicroBeads (Miltenyi) oenriquece haguã umi muestra células CD8+, CD4+ ha CD45- (hielo ári). Mbykyhápe, umi célula oñesuspende jey tampón enriquecimiento celular-pe (ojehechaháicha yvateve) ha ojeipapa. Umi célula oñeincuba yvypóra CD8 perla, yvypóra CD4 perla térã yvypóra CD45 cuenta (Miltenyi) reheve 4°C-pe 15 minuto aja, ha upéi ojejohéi tampón enriquecimiento celular reheve. Pe muestra ojehasa columna LS (Miltenyi) rupive, ha oñembyaty umi fracción positiva ha negativa. Ikatu hag̃uáicha oñemboguejy pe ipukukue ha oñembotuichave pe paso recuperación celular rehegua, upéi ojeporu pe CD8-fracción mokõiha ronda de enriquecimiento CD4+-pe g̃uarã, ha pe CD4-fracción ojeporu pe CD45-enriquecimiento oúvape g̃uarã. Ñañongatu pe solución hielo ári pe proceso de separación pukukue javeve.
Oñembosako i hagua muestra ojejapo hagua análisis metabolito rehegua, ojejohéi petet jey umi célula solución juky ro ysã hieloicha, ha oñembojehe a 1 ml metanol 80% petettet muestra rehe, upéi ojejapo vortex ha oñecongelar snap nitrógeno líquidope. Umi muestra ojejapo mbohapy ciclo congelación-descongelación ha oñecentrifugákuri 14.000 rpm-pe 15 minuto aja 4°C-pe. Pe sobrenadante oguerekóva umi metabolito oñembohyku iseko peve. Umi metabolito ojedisuelve jey 50 μl ácido fórmico 0,03%-pe, ojejapo vortex oñembojehe a hagua, ha upéi oñecentrifugákuri ojeipe a hagua umi escombro.
Ojepe’a umi metabolito oje’e haguéicha yvateve. Oñembohasa pe sobrenadante petet botella cromatografía líquida de alto rendimiento-pe ojejapo hagua investigación metabolómica rehegua. Eipuru petet protocolo tratamiento aleatorio rehegua eñangareko hagua petettet muestra rehe petet número ojoajúva célula rehe ani hagua oiko umi efecto lote rehegua. Rojapo peteî evaluación cualitativa metabolito global oñemoherakuãva'ekue yma Espectrómetro de Masa Triple Cuadrúpolo AB SCIEX QTRAP 5500 ( 50 ). Ojejapo análisis cromatográfico ha integración área pico ojeporúvo software MultiQuant versión 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Ojeporu conteo de iones 1000 ojeestima haguã valor metabolito ofaltáva, ha ojeporu TIC peteîteî muestra okalkula haguã área pico normalizado peteîteî metabolito ojejuhúva oñemyatyrõ haguã umi cambio omoingéva análisis instrumental procesamiento muestra-gui. Oñenormalisávo TIC, ojepuru MetaboAnalystR(51) (parámetro por defecto) conversión logarítmica ha escalado automático línea norma rehegua. Roipuru PCA orekóva paquete R vegano rojapo haguã análisis exploratorio diferencia metabólomo umi tipo de muestra apytépe, ha roiporu análisis de redundancia parcial roanalisa haguã umi paciente. Jaipuru método Ward jajapo hagua petet dendrograma mapa haku rehegua ñamohenda hagua agrupación distancia euclídea muestra apytépe. Roipuru limma (52) abundancia metabolito estandarizado rehe rohechakuaa haguã metabolito diferencialmente abundante opaite tipo celular ha microambiente pukukue. Ikatu hag̃uáicha oñembohape pe ñemyesakã, jaipuru parámetro promedio grupo rehegua ja especifika hagua modelo, ha ñahesa yijo umi tipo de célula microambiente-pe petettet grupo ramo (n = 6 grupo); pe prueba de significancia-pe guarã, rojapo mbohapy medición ojejapóva jey jey peteĩteĩ metabolito-pe guarã Ani haguã ojejapo replicación japu, oñemoinge paciente-pe obstáculo ramo diseño limma-pe. Ikatu haguã ojesareko diferencia metabolito-kuéra orekóva diferentes pacientes, romohenda modelo limma oimehápe umi paciente de manera fija. Romombe'u significación orekóva contraste preespecificado tipo celular ha microambiente Padj <0,05 (corrección Benjamini-Hochberg).
Ojejapo rire enriquecimiento vigor ojeporúvo Kit de Remoción de Células Muertas Miltenyi (>80% viabilidad), ojejapo secuenciación transcriptoma de células únicas umi ascitis congelada en vivo total ha muestra tumoral ojeporúvo protocolo de expresión génica 10x 5′. Oñeanaliza cinco káso orekóva tumor ha ascitis ojoajúva, jepénte baja viabilidad peteî muestra tumoral ojoko inclusión. Ojehupyty hagua múltiple selección umi paciente rehegua, rombojoaju umi muestra petet paciente rehegua umi carril controlador de cromo 10x-pe, ha roanalisa umi ascitis ha tumor tenda por separado. Ojejapo rire secuenciación [Illumina HiSeq 4000 28×98 pb extremo pareado (PE), genoma Quebec-pegua; peteî promedio 73.488 ha 41.378 lectura por célula tumor ha ascitis-pe guarã respectivamente]], roiporu CellSNP ha Vireo (53) (oñemopyendáva CellSNP-pe ha'eháicha Pe SNP humano común (VCF) ome'êva GRCh38 oñeasigna peteî identidad donante.Roipuru SNPRelate roinferi haguã identidad hi'aguîvéva (IBS) estado genotipo paciente (IBS), omboykévo células no asignadas ha células identificadas como dúplex ha ombojoajúva donantes entre ascitis ha muestra tumoral ( 54 ). (2792 and 4183 cells from tumor and ascites, respectively) for analysis. We use igraph's (57) Louvain clustering of shared nearest neighbor network (SNN) based on Jaccard distance to cluster cells by expression. The clusters were manually annotated to putative cell types based on marker gene expression and visualized with t-SNE. Cytotoxic T cells are odefiníva expresión CD8A ha GZMA, omboykévo subclústeres orekóva expresión proteica ribosómica baja Roike umi dato publicado Izar et al (16), oimehápe incrustación t-SNE, ikatu ocontrola solapamiento expresión marcador célula inmune ha expresión NNMT.
PBMC ojeipe a umi producto separación leucocitos rehegua (STEMCELL Technologies) centrifugación densidad gradiente Ficoll rupive. Ojepe a célula CD3 + PBMC-gui ojeporúvo cuenta CD3 (Miltenyi). Oĩ térã ndaipóri jave MNA, oñeactiva umi célula CD3+ CD3 ojoajúva chapa rehe (5μg/ml), CD28 soluble (3μg/ml) ha IL-2 (300 U/ml; Proleucina). Ára paha oñembotuichave haguã, ojehecha citometría de flujo rupive viabilidad (Tinte de Viabilidad Fijable eFluor450, eBioscience) ha proliferación (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific). Ojehechakuaa efector rembiapo omokyre'ÿvo células PMA (20 ng/ml) ha ionomicina (1μg/ml) GolgiStop reheve 4 aravo pukukue, ha ojesareko CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) ha TNFα-fluoresceína isotiocianato (FITC) (MAb11, BD). Oñemokyre’ỹ célula qPCR ha ChIP PMA (20 ng/ml) ha ionomicina (1μg/ml) reheve 4 aravo pukukue. Oñembyaty pe sobrenadante ELISA rehegua oñeestimula mboyve ha ojejapo rire PMA (20 ng/ml) ha ionomicina (1 μg/ml) rupive 4 aravo aja.
Ojejapo protocolo fabricante rehegua ojeipe a hagua ARN ojeporúvo RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Eipuru QIAshredder (QIAGEN) embojoaju hagua pe muestra. Eipuru kit ARN a ADNc capacidad yvate (Thermo Fisher Scientific) oñesintetiza haguã ADN complementario (ADNc). Eipuru TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ecuantifika hagua expresión génica (según protocolo fabricante) ko’ã sonda rupive: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliseraldehído-3-fosfato hidrógeno-gui (GAPDH)] ha Hs01010726_m1 (SLC22A2). Umi muestra ojejapo sistema PCR tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems)-pe, pe placa de reacción óptica rápida MicroAmp 96 pozo (Applied Biosystems)-pe, película óptica MicroAmp reheve. Oimeraẽva valor Ct ohasáva 35 ojehecha oîha umbral de detección ári ha oñemarka ndojehechakuaáiva ramo.
Ojejapo ChIP oje e haguéicha yma (58). Mbykyhápe, oñembojehe a umi célula formaldehído reheve (concentración paha 1,42%) ha oñeincuba temperatura ambiente-pe 10 minuto aja. Ojepuru tampón hinchazón suplementado (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl ha 0,1% NP-40) hielo ári 10 minuto aja, upéi ojesuspende jey tampón inmunoprecipitación-pe oje e haguéicha (58 ). Upéi oñesonika pe muestra ko a ciclo reheve: 10 ciclo (20 pulso 1 segundo rehegua) ha petet tiempo estático 40 segundo. Oñeincuba anticuerpos inmunoglobulina G grado ChIP (Tecnología de Señalización Celular; 1μl), histona H3 (Tecnología de Señalización Celular; 3μl), NFAT (Invitrógeno; 3μl) ha SP1 (Tecnología de Señalización Celular; 3μl) muestra ndive 4°CC-pe oñemomýi peteĩ pyhare pukukue. Oñeincuba umi cuenta proteína A (Thermo Fisher Scientific) muestra ndive 4°C-pe oñemboveve mbeguekatu reheve 1 aravo aja, upéi ojeporu perla chelex (Bio-Rad) oñembohetave hagua ADN, ha ojeporu proteinasa K (Thermo Fisher) ojedigesti hagua proteína. Ojekuaa promotor TNFα PCR rupive: tenonde gotyo, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; upéva rangue, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (producto 207 pb). Umi taꞌãngamýi ojapo Image Lab (Bio-Rad) ha oñecuantifika ojeporúvo software ImageJ.
Oñembyaty pe sobrenadante cultivo celular rehegua oje e haguéicha yvateve. Ko determinación ojejapo umi procedimiento fabricante kit ELISA TNFα humano (Invitrogen), kit ELISA IL-2 humano (Invitrogen) ha kit ELISA IFN-γ humano (Abcam). Según protocolo fabricante, ojedilui sobrenadante 1:100 ojehechakuaa haguã TNFα ha IL-2, ha 1:3 ojehechakuaa haguã IFN-γ. Eipuru EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) emedi hagua absorbancia 450 nm-pe.
PBMC ojeipe a umi producto separación leucocitos rehegua (STEMCELL Technologies) centrifugación densidad gradiente Ficoll rupive. Ojepe’a células CD3 + PBMC-gui ojeporúvo cuentas CD3 (Miltenyi). Oĩ térã ndaipóri jave MNA, oñeactiva umi célula CD3+ CD3 ojoajúva chapa rehe (5μg/ml), CD28 soluble (3μg/ml) ha IL-2 (300 U/ml; Proleucina) reheve 3 ára pukukue. Ohasávo 3 ára, oñembyaty umi célula ha ojejohéi salina 0,9% reheve, ha oñecongelar pya e pe pellet. Ojejapo conteo celular citometría de flujo rupive (Cytek Aurora; configuración 3L-16V-14B-8R) ojeporúvo eBeads 123count.
Ojepe’a umi metabolito oje’e haguéicha yvateve. Pe extracto seco oñembojehe a jey petet concentración 4000 equivalente celular/μl-pe. Oñeanalisa pe muestra cromatografía de fase inversa rupive (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ha columna CORTECS T3 (2,1×150 mm, partícula tuichakue 1,6-μm, poro tuichakue 120-Å; #186008500, Waters). Espectrómetro de masas polares (6470, Agilent), upépe ionización electrospray ombaꞌapo modo positivo-pe. Fase móvil A ha e 0,1% ácido fórmico (H2O-pe), fase móvil B ha e 90% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico. Pe gradiente LC ha e 0 a 2 minuto 100% A, 2 a 7,1 minuto 99% B, ha 7,1 a 8 minuto 99% B. Upéi ojeequilibra jey pe columna fase móvil A ndive petet caudal 0,6 ml/min 3 minuto aja. . Pe caudal ha e 0,4ml/min, ha pe cámara columna rehegua oñembohyku 50°C peve. Eipuru MNA estándar químico puro (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canadá) emohenda hagua tiempo de retención (RT) ha transformación (RT = 0,882 minutos, transformación 1 = 137→94,1, transformación 2 = 137→92 , Conversión 3 = 137→78). Mbohapyve transición oiko jave tiempo de retención hekopete, ojepuru transición 1 oñecuantifika hagua ojeasegura hagua especificidad. Pe curva estándar MNA (Toronto Research Chemical Company) rehegua ojejapo seis diluciones en serie pe solución stock rehegua (1 mg/ml) ojehupyty hagua estándar 0,1, 1,0, 10 ha 100 ng/ml ha 1,0 ha 10μg/ml respectivamente líquido. Pe límite de detección ha e 1 ng/ml, ha pe respuesta lineal ha e 10 ng/ml ha 10μg/ml mbytépe. Káda inyección mokõi microlitro muestra ha estándar ojeporu análisis LC/MS-pe guarã, ha ojejapo peteî muestra control de calidad mixta cada ocho inyección oasegura haguã estabilidad plataforma de análisis. Umi MNA ñembohovái opaite muestra celular oñeñangareko va ekue MNA rehe oĩkuri pe rango lineal ensayo ryepýpe. Ojejapo análisis de datos ojeporúvo software análisis cuantitativo MassHunter (v9.0, Agilent).
Pe constructo αFR-CAR mokõiha generación rehegua ojegueru Song et al. (59) rehegua. Mbykyhápe, pe constructo oguereko ko’ã contenido: secuencia líder CD8a, fragmento variable de cadena única específica αFR yvypóra rehegua, bisagra ha región transmembrana CD8a, dominio intracelular CD27 ha dominio intracelular CD3z. Pe secuencia CAR completa oñesintetiza GenScript rupive, ha upéi oñeclona vector de expresión lentiviral mokõiha generación-pe yvate gotyo cassette de expresión GFP ojeporúva ojehecha haguã eficiencia transducción rehegua.
Lentivirus ojejapo oñembohasávo célula HEK293T [Colección Americana de Cultivo de Tipo (ATCC); oñeñotỹva medio Águila modificado Dulbecco-pe oguerekóva 10% suero bovino fetal (FBS) ha 1% PenStrep, ha ojeporu vector CAR-GFP ha Umi plásmido envasado (psPAX2 ha pMD2.G, Addgene) oipuru amina lipofección (Sigma-Aldrich). Pe sobrenadante oguerekóva virus oñembyaty 48 ha 72 aravo transfección rire, ojefiltra ha oñeconcentra ultracentrifugación rupive. Oñongatu pe sobrenadante viral concentrado -80°C-pe oñembohasa peve.
PBMC ojeipe a umi producto separación leucocitos donantes hesãivagui (STEMCELL Technologies) centrifugación densidad gradiente Ficoll rupive. Eipuru microperlas CD8 selección positiva (Miltenyi) ojeipe a hagua célula CD8+ PBMC-gui. Oñemokyre’ỹ células T TransAct (Miltenyi) rupive ha medio TexMACS-pe [Miltenyi; oñembojoapy 3% suero humano inactivado haku rupive, 1% PenStrep ha IL-2 (300 U/ml)]. Veinticuatro aravo ojejapo rire estimulación, oñembohasa célula T lentivirus reheve (10 μl sobrenadante virus concentrado por 106 célula). 1 a 3 ára ojejapo rire transducción Cytek Aurora rehe (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+ rehe), ojeevalua GFP expresión umi célula rehegua ojehechauka hagua eficiencia transducción rehegua por lo menos 30% .
Oñemongakuaa célula CAR-T 24 aravo pukukue Immunocult (STEMCELL Technologies; oñembojoapýva 1% PenStrep)-pe ko a condición-pe: noñeñangarekóiva, oñeñangareko adenosina 250 μM térã MNA 10 mM rehe. Ojejapo rire tratamiento mboyve, ojejohéi célula CAR-T PBS reheve ha oñembojoaju 20.000 célula SK-OV-3 ndive [ATCC; medio McCoy 5A-pe (Sigma-Aldrich) oñembojoapýva 10% FBS ha 1% PenStrep reheve 10-pe: Oñeamplifica mbohapy jey pe relación efector ha blanco 1-pe medio Inmunocult suplementado-pe. Ojeporu control negativo ha positivo ramo umi célula SK-OV-3 ha célula SK-OV-3 lisis digitalis saponina (0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) reheve. Ojejapo rire 24 aravo co-cultivo, oñembyaty pe sobrenadante ha oñemedi lactato deshidrogenasa (LDH) he iháicha fabricante (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Pe sobrenadante LDH ojedilui 1:50 tampón LDH-pe. Ojekuaa porcentaje ojejukáva ojeporúvo ko fórmula: porcentaje ojejukáva = porcentaje de corrección / tasa máxima de muerte x 100%, upépe porcentaje de corrección = células co-cultivo-T añoite, ha tasa máxima de muerte = control positivo-negativo.
Ojeꞌeháicha jehaipyre térã mbaꞌe ha método-pe, ojepuru GraphPad Prism 8, Microsoft Excel térã R v3.6.0 ojejapo hag̃ua análisis estadístico. Oñembyatýramo heta muestra peteĩ hasývagui (ha eháicha ascitis ha tumor), jaipuru peteĩ prueba t pareada térã ñamoinge pe hasývape efecto aleatorio ramo peteĩ modelo lineal térã generalizado-pe oĩháicha. Análisis metabolómica-pe guarã, ojejapo prueba de importancia mbohapy jey.
Umi material suplementario ko artículo-pe g̃uarã, ehecha http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
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Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacarías (Lauren G. Zacarías), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Fineas T. Ñe’ẽpoty ha ñe’ẽpoty ñemoarandu.
MNA oipytyvõ supresión inmune células T ha orepresenta potencial blanco inmunoterapia oñepohano haguã cáncer yvypóra.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacarías (Lauren G. Zacarías), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Fineas T. Ñe’ẽpoty ha ñe’ẽpoty ñemoarandu.
MNA oipytyvõ supresión inmune células T ha orepresenta potencial blanco inmunoterapia oñepohano haguã cáncer yvypóra.
©2021 Asociación Americana de Adelanto de la Ciencia rehegua. opaite derecho ojeguerekóva. AAAS ha’e peteĩ socio HINARI, AGORA, OARE, CORO, CLOCKSS, CrossRef ha CONTADOR. CienciaAvances ISSN 2375-2548 rehegua.